基于介孔二氧化钛的化疗联合光动力治疗的纳米给药系统的研究

摘要

恶性肿瘤是威胁人类生命健康的重大疾病。目前针对恶性肿瘤的治疗方法主要有化疗和放疗两种，这两种方式虽然能在一定程度上遏制肿瘤，但是由于其不具备特异性，差的预后以及肿瘤耐药的存在，导致化疗与放疗的应用具有局限性。光动力治疗（Photodynamic therapy,PDT）是一种氧依赖性光触发的非侵入性治疗方法，在癌症治疗中显示出其独特的优势。对于有效的PDT，通常需要纳米载体来实现光敏剂的肿瘤靶向递送。 介孔二氧化钛纳米粒（Mesoporous titanium dioxide nanoparticles,MTN）是一种被广泛研究的纳米材料，由于其具有低的细胞毒性、适宜的载药孔径以及孔结构，已被研究用于药物递送系统。同时介孔二氧化钛纳米粒本身可以作为PDT的光敏剂。 本论文分为两大部分，第一部分设计并合成了透明质酸（Hyaluronic acid,HA）和环五肽ADH-1修饰的介孔二氧化钛纳米给药系统（ADH-1-HA-MTN），选用阿霉素（Doxorubicin,DOX）作为模型药物，用于探索针对肿瘤上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）细胞的抗耐药研究。采用转化生长因子TGF-β1诱导A549肿瘤细胞，建立了EMT肿瘤细胞模型（A549/EMT），在此基础上，评价了所构建纳米载体的安全性、细胞靶向性、产生活性氧能力、PDT治疗效果以及联合DOX对A549/EMT的细胞毒作用，并进一步探究了其对A549/EMT细胞的抗耐药机制，结果表明ADH-1-HA-MTN对A549/EMT细胞具有良好的靶向递送能力，在X射线照射下能产生活性氧，联合DOX的化疗作用实现对A549/EMT细胞的有效杀伤。蛋白免疫印迹实验表明ADH-1-HA-MTN是通过抑制N-cadherin的表达而阻断EMT过程来克服肿瘤耐药。 本文的第二部分在MTN光动力特性的基础上，进一步将其氧化得到介孔过氧化钛纳米粒(TiOx），并在其表面修饰多肽YSA（YSAYPDSVPMMSK）及聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG），构建具有更强光动力效应的肿瘤靶向纳米给药系统（YSA-PEG-TiOx）。选用斑蝥素（Cantharidin,CTD）作为模型药物，选取A549细胞为研究对象，考察了材料的安全性、细胞靶向性，比较分析了TiOx与MTN产生活性氧能力及PDT治疗效果，并进行了细胞毒研究，结果表明YSA-PEG-TiOx对A549细胞具有靶向性及更强的PDT治疗效果，与CTD联用能够显著提高对A549细胞的细胞毒作用。 综上所述，基于介孔二氧化钛纳米载体构建的肿瘤靶向给药系统能够实现化疗与光动力治疗的联合作用，达到高效杀伤肿瘤的治疗效果。

目录

声明

引言

1 文献综述

1.1 肿瘤的靶向治疗

1.1.1 靶向药物递送系统

1.1.2 被动靶向药物递送系统

1.1.3 主动靶向药物递送系统

1.2 上皮间质转化与肿瘤细胞耐药性的产生

1.2.1 上皮间质转化

1.2.2 N钙黏蛋白（N-cadherin）和环五肽ADH-1

1.3 多肽YSA与EphA2受体

1.4 阿霉素DOX与斑蝥素CTD

1.5 聚乙二醇PEG与透明质酸HA

1.6 光动力疗法与二氧化钛

1.7 本论文的研究思路

1.8 本论文研究的主要内容

2 ADH-1-HA-MTN的合成与表征

2.1 概述

2.2 实验器材与材料

2.2.1 实验器材

2.2.2 实验试剂

2.3 实验方法

2.3.1 靶向材料ADH-1-HA的合成

2.3.2 合成NH2-MTN/DOX

2.3.3 合成ADH-1-HA-MTN

2.3.5 DOX载药量的测定

2.3.6 体外药物释放实验

2.3.7 ADH-1-HA-MTN的粒径和电位测定

2.3.8 ADH-1-HA-MTN形貌观察

2.3.10 ADH-1-HA-MTN的官能团分析

2.3.11 溶血实验

2.4 实验结果与讨论

2.4.1 靶向材料ADH-1-HA的制备

2.4.2 ADH-1-HA-MTN的粒径、电位以及形貌的表征

2.4.4 DOX载药量以及体外药物释放情况

2.4.5 材料的安全性评价

2.5 本章小结

3 ADH-1-HA-MTN/DOX 的抗肿瘤耐药以及PDT 效果评价

3.1 概述

3.2 实验仪器与材料

3.2.1 实验仪器

3.2.2 实验材料

3.3 实验方法

3.3.1 细胞培养以及肿瘤EMT模型的建立

3.3.2 细胞摄取实验

3.3.3 MTN在X射线照射下产生的ROS检测

3.3.4 PDT体外治疗效果评价

3.3.5 体外细胞毒测定

3.3.6 蛋白质免疫印迹分析

3.4 实验结果与讨论

3.4.1 建立和验证EMT细胞模型

3.4.2 体外细胞摄取研究

3.4.3 X射线照射下不同MTN材料产生的ROS检测

3.4.4 PDT体外治疗效果评价

3.4.5 体外细胞毒作用

3.4.6 机制探索与讨论

3.5 本章小结

4 介孔过氧化钛纳米给药系统的构建与表征

4.1 概述

4.2 实验仪器与材料

4.2.1 实验仪器

4.2.2 实验试剂

4.3 实验方法

4.3.1 合成介孔过氧化钛纳米粒

4.3.2 合成NH2-TiOx/CTD

4.3.3 合成YSA-PEG-TiOx/CTD

4.3.4 PEG 及YSA 偶联率的计算

4.3.5 CTD 标准曲线的绘制

4.3.6 CTD 载药量的测定

4.3.8 YSA-PEG-TiOx 的粒径和电位测定

4.3.9 YSA-PEG-TiOx 的形貌观察

4.3.10 YSA-PEG-TiOx 的孔径及介孔结构测量

4.3.11 YSA-PEG-TiOx 的官能团分析

4.3.12 溶血实验

4.3.13 X 射线光电子能谱分析

4.4 实验结果与讨论

4.4.1 YSA-PEG-TiOx 的制备

4.4.2 YSA-PEG-TiOx的粒径、电位以及形貌的表征

4.4.3 YSA-PEG-TiOx的官能团，介孔结构以及热重分析

4.4.4 CTD载药量以及体外药物释放

4.4.5 材料的安全性评价

4.4.6 X射线光电子能谱分析

4.5 本章小结

5 YSA-PEG-TiOx/CTD 的抗肿瘤以及PDT 效果评价

5.1 概述

5.2 实验仪器与材料

5.2.1 实验仪器

5.2.2 实验试剂

5.3 实验方法

5.3.1 细胞培养

5.3.2 细胞摄取实验

5.3.3 MTN与TiOx在X射线照射下产生的ROS检测

5.3.4 PDT体外治疗效果评价

5.3.5 体外细胞毒测定

5.3.6 细胞凋亡检测

5.4 实验结果与讨论

5.4.1 体外细胞摄取研究

5.4.2 X射线照射下不同TiOx材料产生的ROS检测

5.4.3 PDT对体外不同TiOx的治疗作用

5.4.4 体外细胞毒研究

5.5 本章小结

结论

创新点

参 考 文 献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢

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