PAHs污染对农田土壤微生物群落组成的影响

摘要

近年来，农田土壤中有机污染物多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）污染日益加剧，它们可通过植物吸收进入食物链，最终威胁人类健康。有研究表明，PAHs污染可以减少土壤中微生物的多样性，同时它们也能够被某种特殊的微生物当作碳源，刺激微生物生长，从而形成新的微生物群落结构，从中可发掘降解PAHs的优势微生物，对于生物修复技术发展具有重要意义。本文选取PAHs污染的实际农田土壤，通过比较根际和非根际土壤的细菌群落组成差异，分析降解PAHs的环羟化双加氧酶基因丰度，进一步明确优势微生物种类。此外，利用实验室已分离的菲降解菌Pseudomonas sp.JM2-gfp接种水稻开展根箱培养实验，探讨外源降解菌对菲污染土壤中的土著微生物群落的扰动，为有机污染农田土壤的生物修复提供科学依据。研究结果如下： （1）研究PAHs污染对农田土壤微生物活性的影响。采集辽宁省某油田附近的农田土壤，检测发现16种PAHs总浓度为38884μg/kg，属严重污染。检测土壤的微生物活性指标包括微生物生物量碳、可培养细菌数量和微生物呼吸强度发现，污染土壤的微生物活性低于附近未污染土壤，而根际土壤微生物活性高于非根际土壤。 （2）通过16S rDNA高通量测序和实时荧光定量PCR（qPCR）研究PAHs污染农田根际和非根际土壤中细菌群落组成差异。测序结果显示，根际土壤中细菌群落多样性指数明显高于非根际土壤，而且在PAHs污染的农田土壤中存在丰富的优势微生物资源，包括伯克霍尔德氏菌科、地杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、Sulfuricurvum和硫杆菌属等。与非根际土壤相比，根际土壤中的地杆菌属和硫杆菌属相对丰度提高。qPCR结果显示，根际土壤中环羟化双加氧酶基因拷贝数明显高于非根际土壤，说明地杆菌属和硫杆菌属可能具有降解PAHs的微生物资源。 （3）研究添加菲降解菌对水稻根际细菌群落的影响。结果发现，在菲污染的土壤中培养60天后，JM2-gfp能够在水稻根部定殖存活，定殖后的根际土壤细菌群落多样性指数略低于没有JM2-gfp定殖的根际土壤，但是变形菌门比例大幅度提高，尤其是优势功能菌中的根瘤菌科、鞘氨醇单胞菌属和新鞘氨醇杆菌属的细菌相对丰度明显增加。

目录

声明

引言

1 PAHs对农田土壤微生物群落的影响

1.1 农田土壤微生物

1.1.1 土壤微生物的作用

1.1.2 农田土壤微生物的生态功能

1.2 研究微生物群落的方法及分析指标

1.2.1 稀释平板计数

1.2.2 Biolog微平板法

1.2.3 DGGE变性梯度凝胶电泳

1.2.4 高通量测序

1.2.5 微生物群落的Alpha多样性指标

1.3 PAHs污染现状

1.3.1 PAHs的性质和来源

1.3.2 土壤PAHs污染现状

1.3.3 PAHs降解相关的微生物

1.4 PAHs污染农田土壤的微生物效应研究现状与展望

1.4.1 PAHs污染对土壤微生物活性的影响

1.4.2 PAHs污染土壤的微生物多样性

1.5 本论文研究目的及意义

2 PAHs污染对土壤微生物活性的影响

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 主要试剂

2.2.2 主要仪器

2.3 实验方法

2.3.1 土壤样品的采集

2.3.2 16种PAHs标准曲线的绘制

2.3.3 土壤中PAHs的提取和检测方法

2.3.4 稀释平板计数法

2.3.5 氯仿熏蒸-K2SO4浸提法

2.3.6 土壤呼吸强度测定方法

2.3.7 数据处理方法

2.4 结果与讨论

2.4.1 土壤中16种PAHs的含量及组成分析

2.4.2 PAHs对土壤微生物生物量的影响

2.4.3 PAHs对土壤微生物呼吸强度的影响

2.5 本章小结

3 PAHs对农田土壤细菌群落组成的影响

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 主要试剂

3.2.2 主要仪器

3.2.3 主要溶液及配制方法

3.3 实验方法

3.3.1土壤基因组DNA的提取和16S rDNAPCR扩增

3.3.2 PCR产物纯化

3.3.3 文库构建和上机测序

3.3.4 荧光实时定量PCR

3.3.5 OTU聚类和物种注释

3.3.6样本复杂度分析（Alpha Diversity）

3.4 结果与讨论

3.4.116S rDNA基因测序深度分析结果

3.4.2 土壤细菌Alpha多样性指数分析结果

3.4.3 农田土壤微生物分类及分析结果

3.4.4 PAHs降解关键功能基因定量分析

3.5 本章小结

4 添加菲降解菌对水稻根际细菌群落组成的影响

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 菌株及植物材料

4.2.2 主要试剂

4.2.3 主要仪器

4.2.4 主要溶液及配制方法

4.3 实验方法

4.3.1 人工制备菲污染土壤

4.3.2 水稻培养

4.3.3 菲降解菌的定殖

4.3.4 根箱试验

4.3.5 数据分析

4.4 结果与讨论

4.4.1 外源菲降解菌在水稻根表的定殖结果

4.4.2 外源菲降解菌对水稻根际土壤细菌群落的多样性影响

4.4.3 外源菲降解菌对水稻根际土壤细菌群落组成的影响

4.5 本章小结

结论

展望

参考文献

致谢

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