人工合成微生物菌群生产1,3-丙二醇

摘要

微生物菌群的多样性和鲁棒性能够令其在复杂的环境中进行生长和代谢。随着微生物组学及其技术的发展，菌群的结构及功能可以轻易获知，菌群发酵得以发展。然而，功能冗余、优势功能难以集成以及菌群稳定性等问题尚未解决，菌群的应用仍然具有局限性。为解决上述问题，本论文主要从以下两个方面开展研究工作：一、新的功能菌群的发现及其功能的开发；二、构建去冗余、功能集成的人工菌群用于1,3-丙二醇生产。 首先，采取厌氧连续传代的策略，筛选得到一组发酵性能稳定且传代过程呈现“高梭菌低杆菌”构型的微生物菌群DUT08，Clostridium（85%-95%）、Escherichia（5%-15%）及少量的Klebsiella（0.007%-0.012%）。根据生长和代谢差异分离得到C.butyricum DUT1、K.pneumonia DUT2和E.coli DUT3三株核心功能菌。 其次，探究了菌群和核心功能菌的发酵性能。研究结果表明C.butyricum DUT1与E.coli DUT3存在互利共生关系；C.butyricum DUT1和K.pneumonia DUT2之间不仅存在竞争，同时存在偏利共生关系。另外，E.coli DUT3的存在能够弱化K.pneumonia DUT2对C.butyricum DUT1的竞争，强化两者之间的偏利共生关系。发现：（1）无N2通入时，K.pneumonia DUT2将取缔C.butyricum DUT1成为优势菌，主控代谢流。（2）提升N2通气量将有利于Clostridium的生长，菌群的发酵性能也会随之提高。当N2通气量为0.20vvm时，DUT08的发酵性能最佳，1,3-丙二醇的生产能力达到61.49g/L、0.55g/g和2.46g/(L·h)。（3）在上述关系协助下，即便短期（3h）、低N2通量（0.02vvm），菌群亦可实现厌氧发酵，1,3-丙二醇的生产能力达58.33g/L、0.52g/g和1.94g/(L·h)。 最后，根据自然菌群DUT08的结构及核心功能菌之间的关系，构建了由C.butyricum DUT1、K.pneumonia DUT2和E.coli DUT3组成的人工菌群。研究发现，在发酵初期限制C.butyricum DUT1生长和代谢的主要因素为溶氧和底物抑制，后期产物抑制则成为主要限制因素。K.pneumonia DUT2和E.coli DUT3的引入不仅可以提高C.butyricum DUT1对氧的耐受力，还可为其解除底物和产物抑制。人工菌群Syn-CEK在厌氧条件下进行批式流加发酵时，1,3-丙二醇产量达到81.39g/L；即便在短期（3h）、低N2通量（0.02vvm）条件下，1,3-丙二醇产量也能达到77.68g/L，相比于C.butyricum DUT1，Syn-CEK的生产能力提升了20%。 综上，以上的研究结果为微生物转化粗甘油生产1,3-丙二醇提供了新的技术路线和理论指导。

目录

声明

引言

1 文献综述

1.1 微生物组学的发展

1.1.1 从微生物到微生物组学

1.1.2 微生物组学的研究方法

1.2 工业微生物组学的应用

1.2.1 生物能源

1.2.2 生物基化学品

1.2.3 生物材料

1.3 人工微生物组学的研究

1.3.1 基于群体感应（Quorum sensing, QS）系统的细胞通讯

1.3.2 基于功能互补的共生关系

1.3.3 基于逻辑运算的菌群时空动态变化研究

1.3.4 人工微生物组学面临的问题与挑战

1.4 微生物菌群转化粗甘油生产1,3-丙二醇

1.4.1 生产1,3-丙二醇的方法

1.4.2 生产1,3-丙二醇的原料和菌株

1.4.3 生产1,3-丙二醇的代谢途径及培养模式

1.4.4 生产1,3-丙二醇的发酵工艺

1.5 本课题的研究内容及意义

2 产1,3-丙二醇的微生物菌群筛选

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 样品来源

2.2.2 培养基

2.2.3 实验试剂

2.2.4 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 培养方法

2.3.2 微生物菌群的筛选

2.3.3 微生物菌群的简化

2.3.4 核心功能菌株的分离、纯化

2.3.5 微生物菌群的结构鉴定与稳定性分析

2.3.6 核心功能菌株的鉴定

2.3.7 分析方法

2.4 实验结果与讨论

2.4.1 微生物菌群的筛选

2.4.2 微生物菌群DUT08的结构鉴定与稳定性分析

2.4.3 微生物菌群DUT08的简化

2.4.4 核心功能菌株的分离、纯化与鉴定

2.5 小结

3 微生物菌群及核心功能菌发酵性能的研究

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 实验菌种

3.2.2 培养基

3.2.3 实验试剂

3.2.4 实验仪器

3.3 实验方法

3.3.1 种子培养

3.3.2 批式发酵

3.3.3 分析方法

3.4 实验结果与讨论

3.4.1 微生物菌群DUT08的底物耐受性

3.4.2 通气量对DUT08发酵性能及菌群结构的影响

3.4.3 核心功能菌株发酵性能研究

3.4.4 简化菌群发酵性能的研究

3.5 小结

4 人工合成微生物菌群的设计与构建

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 实验菌种、质粒及引物

4.2.2 实验试剂

4.2.3 实验仪器

4.2.4 培养基

4.3 实验方法

4.3.1 种子培养

4.3.2 批式及批式流加发酵

4.3.3 分析方法

4.4 实验结果与讨论

4.4.1 人工合成微生物菌群微氧发酵性能的研究

4.4.2 人工合成微生物菌群批式发酵性能的研究

4.4.3 人工合成微生物菌群批式流加发酵性能的研究

4.4.4 批式流加发酵过程中菌群动态变化

4.5 小结

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢

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