不同酰基-酰基载体蛋白突变体的合成及其反应活性研究

摘要

生物途径合成的甘油三酯（TAG）是重要的生物能源前体。酰基-酰基载体蛋白（acyl-ACP）作为其合成途径中的重要底物，与甘油三磷酸（G-3-P）在甘油三磷酸酰基转移酶（GPAT）的催化下生成的溶血磷脂酸（LPA）是TAG合成路径中第一个反应，对于TAG的合成起着重要的调控作用。因此对于acyl-ACP与GPAT的反应研究具有重要意义。在ACP作为acyl-ACP底物的部分参与到GPAT催化酰基转移反应时，通常仅视为酰基链为GPAT的催化选择性，而忽略了ACP在其中的贡献，这种选择机制的误解存在于很多催化ACP反应的酶中。因此为了能够研究acyl-ACP的ACP部分对GPAT的选择性贡献，获得不同链长acyl-ACP及其突变体，并对其与GPAT的反应活性进行分析研究是深入了解ACP的结构和功能，并认识ACP参与酶反应动力学分子机制的重要前提。 本研究根据野生型ACP的氨基酸序列及三维结构信息，设计了涉及11个氨基酸位点共12株ACP突变体。体外构建12株ACP突变体的表达质粒并在大肠杆菌中可溶表达。在acyl-ACP合成酶的作用下将结合了4’-磷酸泛酰巯基乙胺基团（4’-PPT）的活性ACP（holo-ACP）与16:0、18:1游离脂肪酸反应合成16:0-ACP和18:1-ACP并通过体积排阻色谱对其进行纯化。最后将16:0-ACP与18:1-ACP及其突变体与GPAT进行酶活测定，对其反应活性进行分析。 结果表明，对ACP的12株突变体进行蛋白表达纯化，其目的蛋白的表达量、体积排阻色谱中的洗脱体积及holo-ACP在高效液相色谱（HPLC）中检测纯度有所差异。通过HPLC对合成后的16:0-ACP和18:1-ACP合成产物经纯化后进行定性及定量分析，研究发现不同链长的acyl-ACP及其突变体的稳定性发生改变，纯度差异显著。此外，在与GPAT的酶活检测中，与WT相比，ACP定点突变后的16:0-ACP和18:1-ACP与GPAT的反应活性发生了明显的变化，GPAT对于链长的偏好程度也有所改变，初步证明了ACP部分参与GPAT的相互作用中具有一定的贡献。 综上，16:0-ACP和18:1-ACP及其突变体与GPAT反应活性的研究为以后ACP的结构和功能以及与相关酶的相互作用机制奠定了基础。

目录

声明

引言

1 文献综述

1.1微藻与生物柴油

1.1.1 微藻的介绍

1.1.2 生物柴油的概念

1.1.3 微藻生物柴油的独特优势

1.1.4 微藻生物柴油的机遇

1.2甘油三酯的合成

1.2.1 脂肪酸合成途径

1.2.2 TAG合成途径

1.3酰基载体蛋白概述

1.3.1 酰基载体蛋白的研究概况

1.3.2 ACP的结构研究

1.4 酰基载体蛋白的工业应用

1.5 甘油-3-磷酸酰基转移酶的概述

1.6 acyl-ACP与GPAT相互作用研究进展

1.7 本论文的研究内容和研究思路

1.6 本论文立题目的和意义

2 不同acyl-ACP突变体的制备

2.1引言

2.2 实验材料

2.2.1 主要仪器

2.2.2 主要实验材料

2.2.3 培养基

2.2.4 主要溶液

2.3 实验方法

2.3.1 感受态细胞的制备

2.3.2 热激法转化质粒

2.3.3 ACP突变体的设计及构建

2.3.4 holo-ACP不同突变体的诱导表达

2.3.5 holo-ACP的纯化

2.3.6 acyl-ACP合成酶AasS的表达纯化

2.3.7 不同链长acyl-ACP及其突变体的合成

2.3.8 SDS-PAGE检测重组蛋白表达纯化

2.3.9 Bradford法测定蛋白浓度

2.3.10 HPLC定量检测holo-ACP、acyl-ACP含量

2.4 实验结果与讨论

2.4.1 holo-ACP突变体表达纯化性质差异

2.4.2 HPLC检测分析acyl-ACP性质差异

2.4.3 acyl-ACP的稳定性差异

2.5 小结

3 不同链长acyl-ACP及其突变体与GPAT的酶活测定

3.1引言

3.2实验材料

3.2.1主要仪器

3.2.2实验试剂

3.2.3 主要溶液

3.3 实验方法

3.3.1 LiGPAT的诱导表达

3.3.2 LiGPAT纯化

3.3.3 acyl-ACP与LiGPAT的酶活测定16:0-ACP与LiGPAT的酶活测定

3.3.4 HPLC检测GPAT与acyl-ACP的活性

3.4 实验结果与讨论

3.4.1 16:0-ACP突变体酶活测定反应特性比较

3.4.2 18:1-ACP突变体酶活测定反应特性比较

3.4.3 LiGAPT对酰基链长的选择性

3.5 小结

结论与展望

展望

参考文献

附录A 缩略语表及名称说明

附录B E.coli-ACP序列

附录C ACP质粒图

附录D Holo-ACP凝胶过滤色谱图

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢

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