转录因子KLF5调控宫颈癌细胞上皮间充质转化的分子机制

摘要

在全球范围内，宫颈癌占所有女性癌症的近12%，这使其成为世界上第四大最常见的女性癌症，是全球重大的健康挑战。据WHO报道，2018年估计有57万个新发病例，约有31万人死亡。宫颈癌的治疗依据病理发展程度的诊断，可以采取手术或者化疗，或兼而有之。但是对转移或者复发性的患者，整体预后表现很差，仍然需要进一步深入的研究。 上皮间充质转化是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。为了探究KLF5在调控宫颈癌细胞发生EMT过程的分子机制，首先，探究过表达KLF5对宫颈癌细胞系的影响。对几种宫颈癌细胞系中KLF5基因的表达情况进行了检测，为本研究选定了细胞系HeLa和SiHa细胞系。通过MTT法、细胞划痕、Transwell等实验检测KLF5对宫颈癌细胞系增殖、侵袭和转移的影响。研究发现：在HeLa细胞中过表达KLF5后，MTT法实验显示细胞的增殖能力没有显著地变化；细胞划痕和Transwell实验说明，KLF5可以显著地抑制HeLa细胞的迁移和侵袭能力；在SiHa细胞中沉默KLF5促进了细胞的迁移和侵袭。 其次，研究转录因子KLF5对EMT相关分子表达的影响。分别选取HeLa细胞和SiHa细胞为研究对象，通过real-time PCR和Western blot实验来检测EMT相关分子的表达情况。实验结果显示过表达KLF5可以促进HeLa细胞中E-cadherin的表达，抑制N-cadherin和MMP9的表达，且其上游转录因子SNAI1表达下调。而使用siRNA沉默KLF5可以抑制SiHa细胞中E-cadherin的表达，促进N-cadherin的表达，且其上游转录因子SNAI1表达上调。 再次，研究KLF5调控SNAI1启动子活性。通过数据库JASPAR分析了SNAI1启动子区域的KLF5结合位点，发现了多个结合位点，并据此构建了不同长度的SNAI1启动子截短体质粒，利用荧光素酶报告基因检测KLF5对SNAI1启动子截短体活性的影响，分析KLF5可能结合到SNAI1启动子区域的-200~-100区域来抑制SNAI1的表达。 最后，为了进一步验证KLF5是通过SNAI1介导的EMT过程来调控宫颈癌细胞的转移和侵袭能力。选择在HeLa细胞过表达SNAI1，通过real-time PCR和Western blot实验来检测EMT相关基因的表达情况。实验结果显示过表达KLF5可以抑制HeLa细胞中E-cadherin的表达，促进N-cadherin和MMP9的表达，且转录因子SLUG、ZEB1/2、TWIST1的表达上调。因此表明SNAI1在宫颈癌可以调控宫颈癌细胞的EMT过程。

目录

声明

引言

1 文献综述

1.1 宫颈癌

1.1.1 宫颈癌发病原因

1.1.2 宫颈癌的筛查和预防

1.1.3 宫颈癌的诊断与治疗

1.1.4 宫颈癌转移

1.2 上皮间充质转化综述

1.2.1 EMT简介

1.2.2 EMT信号通路

1.2.3 EMT与宫颈癌

1.3 KLF 5综述

1.3.1 KLF5简介

1.3.2 KLF5的靶向调控

1.3.3 KLF5的生物学功能

1.3.4 KLF5与宫颈癌

1.4 SNAI1概述

1.4.1 SNAI1简介

1.4.2 SNAI1的表达调节

1.4.3 SNAI1的生物学功能

1.5 本论文的选题依据和研究内容

1.5.1 选题依据

1.5.2 研究内容

2 过表达KLF5对宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

2.1 引言

2.2 仪器与试剂

2.2.1 仪器与设备

2.2.2 试剂

2.3 实验与方法

2.3.1 质粒扩增

2.3.2 细胞培养

2.3.3 细胞转染

2.3.4 Western Blot检测

2.3.5 Real-time PCR检测

2.3.6 KLF5的干扰

2.3.7 MTT法检测细胞增殖

2.3.8 细胞划痕和Transwell实验

2.3.9 统计分析

2.4 结果分析

2.4.1 宫颈癌细胞内源KLF5蛋白和mRNA表达检测

2.4.2 外源Flag-KLF5质粒和siKLF5表达情况

2.4.3 KLF5对HeLa细胞增殖能力的影响

2.4.4 KLF5对宫颈癌细胞侵袭和迁移能力的影响

2.5 讨论

2.6 小结

3 KLF5对宫颈癌细胞迁移相关基因表达的影响

3.1 引言

3.2 仪器与试剂

3.2.1 仪器与设备

3.2.2 试剂

3.3 实验与方法

3.3.1 细胞培养

3.3.2 细胞转染

3.3.3 Western Blot检测

3.3.4 Real-time PCR检测

3.3.5 统计分析

3.4 结果分析

3.4.1 过表达KLF5对HeLa细胞EMT相关分子mRNA表达的影响

3.4.2 过表达KLF5对HeLa细胞EMT相关分子蛋白表达的影响

3.4.3 沉默KLF5对SiHa细胞EMT相关分子mRNA 表达的影响

3.4.4 沉默KLF5对SiHa细胞EMT相关分子蛋白表达的影响

3.5 讨论

3.6 小结

4 KLF5对SNAI1启动子活性的影响

4.1 引言

4.2 仪器与试剂

4.2.1 仪器与设备

4.2.2 试剂

4.3 实验与方法

4.3.1 SNAI1启动子区域的KLF5结合位点的预测

4.3.2 基因组DNA提取

4.3.3 不同长度SNAI1-Luc截短体质粒的构建

4.3.4 细胞培养

4.3.5 细胞转染

4.3.6 荧光素酶报告基因

4.3.7 统计分析

4.4 结果分析

4.4.1 SNAI1启动子区域KLF5的结合位点的预测

4.2.2 不同长度SNAI1-Luc截短体质粒的构建

4.4.3 KLF5基因抑制SNAI1启动子的活性

4.4.4 KLF5抑制SNAI1-Luc-200启动子的活性

4.5 讨论

4.6 小结

5 SNAI1对HeLa细胞EMT过程的影响

5.1 引言

5.2 仪器与试剂

5.2.1 仪器与设备

5.2.2 试剂

5.3 实验与方法

5.3.1 质粒扩增

5.3.2 细胞培养

5.3.3 细胞转染

5.3.4Western Blot检测

5.3.5 Real-time PCR检测

5.3.6 统计分析

5.4 结果分析

5.4.1 过表达SNAI1对HeLa细胞EMT相关分子mRNA表达的影响

5.4.2 过表达SNAI1对HeLa细胞EMT相关分子蛋白水平的影响

5.5 讨论

5.6 小结

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位论文期间发表学术论文情况

致谢

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