CRM1靶向抑制剂对ENKTL治疗潜力的研究

摘要

染色体维持蛋白1（CRM1）是细胞中负责蛋白主动转运的核输出受体。研究表明，CRM1的异常活化在肿瘤的发生、抗凋亡等方面起到了重要作用，因而成为抗肿瘤药物研发的潜在靶标。结外NK/T细胞淋巴瘤（ENKTL），是一种罕见的且恶性程度很高的非霍奇金淋巴瘤。ENKTL的致病机制一直不明确，现行的治疗方法虽然能起到一定作用，但预后较差，治疗效果不佳。在本次研究中，我们首先通过计算机辅助药物设计，利用虚拟筛选结合分子对接、分子动力学模拟等手段，得到CRM1的共价靶向抑制剂。后利用体外实验分析了小分子抑制剂与CRM1疏水活性口袋反应性半胱氨酸残基靶向结合的情况。再以结外NK/T细胞淋巴瘤细胞为实验对象，探究小分子抑制剂对ENKTL的治疗潜力及其作用机制。最后通过外周血单核淋巴细胞（PBMC）毒性测试、血小板毒性测试以及动物实验评估了小分子抑制剂对宿主的安全性，为ENKTL这一罕见肿瘤的治疗提供新颖的靶向治疗策略。 本研究主要得到以下结论： （1）基于计算机辅助药物设计的方法，以本课题组前期得到的CRM1天然小分子抑制剂LFS-01的结构为基础，得到了靶向性更强的新型CRM1共价抑制剂LFS-829，通过分子动力学模拟分析了二者间的靶向作用主要由LFS-829的亲电弹头和CRM1疏水活性口袋的半胱氨酸残基发挥作用。 （2）利用X-射线晶体衍射技术、质谱实验分析、表面等离子体共振技术（SPR）分析证实了LFS-829与CRM1疏水槽反应性半胱氨酸残基共价结合而靶向CRM1，小分子化合物LFS-829与CRM1之间的亲和力常数KD值约为26.95nM。以293T细胞为研究对象测定LFS-829对CRM1核输出功能的半数抑制浓度约为158.1nM。 （3）LFS-829能够有效抑制SNK6、HANK-1等ENKTL细胞系的细胞增殖活性，作用于细胞72h的半数抑制浓度（IC50）分别为366nM和158nM。在SNK6细胞中，LFS-829通过抑制CRM1介导的核输出，使IκB-α在核内积聚，进而抑制NF-κB信号转导通路下游抗凋亡蛋白的表达，促使肿瘤细胞发生凋亡。无论是在PBMC毒性测试、血小板毒性测试以及动物的急毒实验中，LFS-829均表现出对宿主良好的安全性。

目录

声明

引言

1 文献综述

1.1 ENKTL研究现状

1.1.1 结外NK/T细胞淋巴瘤

1.1.2 ENKTL的诱发因素

1.1.3 EBV在ENKTL中的作用

1.1.4 ENKTL治疗现状

1.2 核输出因子CRM1及其介导的核输出过程

1.2.1 CRM1的结构

1.2.2 CRM1介导的核输出过程

1.2.3 CRM1与肿瘤

1.2.4 CRM1抑制剂

1.3 NF-κB信号通路

1.3.1 NF-κB转录因子

1.3.2 κB蛋白抑制剂

1.3.3 NF-κB信号转导通路下游蛋白及炎症因子

1.4 NF-κB/IκB与CRM1

1.5 本论文研究内容、目的及意义

2 计算机辅助CRM1共价靶向抑制剂的设计与筛选

2.1 引言

2.2 实验材料与方法

2.2.1 基于片段的药物设计

2.2.2 ADME/T药物评价

2.2.3 共价对接

2.2.4 分子动力学模拟

2.3 实验结果与讨论

2.3.1 建立小分子抑制剂数据库

2.3.2 虚拟筛选打分与鉴定

2.3.3 MD预测LFS-829与CRM1的靶向结合

2.4 本章小结

3 体外实验分析LFS-829对CRM1靶向性及选择性

3.1 引言

3.2 实验材料、试剂与设备

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验设备

3.3 实验方法

3.3.1 MALDI-TOF质谱分析实验

3.3.2 利用Biacore分析蛋白与小分子间的相互作用

3.3.3 CRM1与LFS-829共结晶的X-射线晶体衍射

3.3.4 Pull Down实验

3.3.5 以细胞表型为基础的核输出功能分析

3.4 实验结果与讨论

3.4.1 CRM1野生型及突变肽段与LFS-829结合质谱分析

3.4.2 Biacore分析LFS-829与CRM1的亲和力强度

3.4.3 LFS-829与CRM1共结晶结构分析与Pull-down实验

3.4.4 LFS-829对和细胞核输出功能的抑制效果

3.5 小结

4 LFS-829对ENKTL的治疗潜力及机制探究

4.1 引言

4.2 实验材料与仪器

4.2.1 主要仪器与耗材

4.2.2 材料与试剂

4.3 实验方法

4.3.1 细胞培养及瞬转细胞株构建

4.3.2 CCK-8细胞增殖活性检测

4.3.3 活细胞工作站观察细胞形态

4.3.4 免疫荧光实验

4.3.5 Western-Blot检测蛋白表达水平

4.3.6 双荧光素酶报告基因检测NF-κB转录活性

4.3.7 动物急毒实验

4.3.8 Elisa检测炎症因子表达水平

4.3.9 流式细胞术检测细胞凋亡

4.4 实验结果与讨论

4.4.1 临床样本分析CRM1在ENKTL发病机制中的重要作用

4.4.2 LFS-829对ENKTL细胞系增殖活性及细胞形态的影响

4.4.3 LFS-829对CRM1干扰细胞增殖活性的影响

4.4.4 LFS-829靶向CRM1抑制IκB-α等货物蛋白的细胞核输出

4.4.5 LFS-829对NF-κB信号通路的影响

4.4.6 LFS-829诱导ENKTL发生细胞凋亡

4.4.7 LFS-829是CRM1的靶向可逆抑制剂

4.4.8 LFS-829的安全性检验

4.5 小结

结 论

展 望

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢

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