中国特有濒危植物穗花杉的遗传多样性分析及其保育

摘要

从7个天然居群(井冈山西平、井冈山和遂川交界处、铜鼓龙门、宜丰官山大西坑、小西坑、宜春明月山和军峰山)和一个栽培居群(庐山居群)采集穗花杉样本，以改良CTAB法从穗花杉叶片中制备模板DNA，优化了PCR循环参数，建立了RAPD-PCR和ISSR-PCR扩增的最佳反应体系，筛选出能扩增多态性片段较多且扩增稳定的引物，通过用12条RAPD引物和10条ISSR引物分别对74个和66个穗花杉个体的基因组DNA进行扩增，对穗花杉居群的遗传多样性和遗传结构进行了研究。 实验结果表明CTAB提取液中丙酮去色素处理可以提高产物的纯度，但产率较低；另外CTAB提取液的抽提时间对产率影响较小。RAPD-PCR扩增条件经过优化后确定为20μlPCR反应体系中，10×Buffer缓冲液2μl，模板70ng，Mg2+2.0mmol/L，dNTPs0.2mmol/L，引物0.60μmol/L，Taq酶1.5U；RAPD最佳扩增程序为94℃5min，1个循环；94℃1min、37℃1min、72℃2min，40个循环；72℃10min，1个循环。ISSR扩增条件经过优化后确定为：20μlPCR反应体系中，2μl10×Taq酶配套缓冲液，1.8UTaq聚合酶(上海生工公司)，0.2μmol/l引物，0.18mmol/ldNTPs，1.5～2.5mmol/lMgCl2，10ng/μl模板DNAISSR-PCR扩增反应程序：94℃5min，1个循环；94C30S，50℃(46-54℃不定)45S，72℃1.5min，35个循环；72℃7min，1个循环；4℃30min。 本研究共对120条RAPD引物和100条ISSR引物进行了筛选，分别筛选出扩增条带较多、信号强、背景清晰的12条RAPD引物和10条ISSR引物用于8个居群DNA样本扩增。结果为：RAPD标记技术共产生了90条带，其中多态性带为78条，多态性位点百分率(PPL)为86.67％；ISSR引物标记技术共产生了61条带，其中多态性带为51条，多态性百分率(PPL)83.61％。 根据不同个体的扩增图谱构建了0、1矩阵(其中模糊带和弱带不计)输入计算机。对RAPD数据处理结果如下：POPGENE分析结果表明，穗花杉具有丰富的遗传多样性，官山大西坑(DK)居群遗传多样性水平最高(PPL=74.44％，h=0.3178，I=0.4567)，庐山(LS)居群的遗传多样性水平最低(PPL=10％，h=0.0414，I=0.0605)。Nei's遗传多样性分析和AMOVA分析表明，穗花杉居群间出现了一定的遗传分化(Gst=0.2619，Φst=19.89％)。居群间一定程度的遗传分化可能是由于基因流受阻造成的。根据Nei's遗传距离矩阵构建居群间的遗传关系树状图。由UPGMA聚类分析可知，西平居群和遂川居群先聚为一支，后与庐山居群聚在一起，推测庐山居群是它们的后裔。 对ISSR数据处理结果如下：POPGENE分析表明，与其他的裸子植物相比，穗花杉具有丰富的遗传多样性(Ht=0.2931、Hs=0.2135)。Nei's遗传多样性和AMOVA分析表明，居群间存在有一定的遗传分化(Gst=0.2710，Φst=26.62％)。由UPGMA聚类分析可知，大西坑和小西坑两个居群优先聚类，铜鼓和军峰山聚为一支，西平和遂川聚为一支，居群的亲缘关系与地理距离有一定的相关性。 鉴于穗花杉对生境改变适应性差和对人为干扰敏感，群落稳定性在穗花杉居群遗传多样性保护中的特殊地位，建议把大西坑(DK)和小西坑(XK)居群划入官山自然保护区的保护范围，对其生存空间进行长期、有效的保护。另一方面，在居群间进行植株和幼苗的相互移栽，以提高居群间的基因交流，最大限度保护穗花杉的遗传多样性。

目录

文摘

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一前言

1 DNA分子标记技术中几种常用技术的基本概念和特点

1.1 RFLP(Restriction fragment length ploymorphism，限制性片段长度多 态性)

1.2 RAPD(Random Amplified Ploumorphic，DNA随机扩增多态性DNA)

1.3 AFLP(Amplified Fragment Length Ploymorphism，扩增片段长度多 态性)

1.4 SSR(Single Sequence Repeats，简单序列重复)

1.5 SNPs(Single Nucleotide Ploymorphisms，单核苷酸多态性)

2 DNA分子标记在濒危植物资源保护中的应用

2.1遗传多样性的检测

2.2确定分类地位和进行系统进化研究

2.3遗传图谱构建与基因定位

2.4性别鉴定

2.5亲缘关系的鉴定和辅助育种

2.6种质资源的保护

3穗花杉的研究意义及其分布

4穗花杉当前研究现状

5 RAPD和ISSR技术原理

5.1 RAPD技术原理

5.2 ISSR技术原理

二实验材料

1 DNA提取

1.1供试材料

1.2仪器和设备

1.3试剂和溶液

1.4改良CTAB法[70-71]

1.5基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

1.6基因组DNA浓度测定和纯度检测

1.7 CTAB法的优化

2 RAPD分子标记对穗花杉遗传多样性的分析

2.1实验材料

2.2实验仪器与试剂

2.3最佳反应体系的建立及优化

2.4 PCR热循环参数的优化

2.5随机引物的筛选

2.6 PCR扩增产物的电泳检测

2.7数据统计和分析

3 ISSR分子标记对穗花杉遗传多样性的分析

3.1实验材料

3.2实验仪器与试剂

3.3 ISSR-PCR最佳反应体系的建立

3.4随机引物的筛选

3.5 PCR扩增产物的电泳检测

3.6数据统计和分析

三结果和分析

1 DNA的提取

1.1 CTAB提取方法的优化

1.2基因组DNA凝胶电泳检测

2 RAPD分子标记对穗花杉遗传多样性的分析

2.1 RAPD反应条件的优化

2.2引物筛选

2.3 8个居群74个个体的扩增结果

3 ISSR分子标记对穗花杉遗传多样性的分析

3.1 ISSR-PCR最佳反应体系的建立及结果

3.2引物筛选

3.3 8个居群66个个体的扩增结果

四讨论

1 DNA的提取

2 PCR反应体系的建立和参数的优化

3两种分子标记在穗花杉遗传多样性分析中的比较

4穗花杉的遗传多样性及保护生物学分析

4.1穗花杉的遗传多样性

4.2穗花杉的遗传结构

4.3保护生物学意义

结论

参考文献

致谢