濒危植物华东黄杉遗传多样性分析及保育

摘要

从5个天然居群(江西三清山、安徽休宁、浙江临安、湖南阳明山自然保护区、阳明山老屋场)采集华东黄杉样本，以改良的CTAB法从华东黄杉叶片中制备模板DNA，优化了PCR循环参数，建立了ISSR-PCR扩增的最佳反应体系，筛选出扩增多态性片断较多且扩增产物稳定的引物，通过10条ISSR引物对89个华东黄杉个体的基因组DNA进行扩增，对华东黄杉居群的遗传多样性和遗传结构进行了研究。 研究结果表明：CTAB提取液中的体积和提取时间对模板DNA有一定的影响。ISSR扩增条件为：20μLPCR反应体系中，2μLl0xTaq酶配套缓冲液，1.5U Taq聚合酶，1.5～2.5mmol/L MgCl<,2>，0.2μmol/L引物，0.2mmol/L dNTPs，10ng/L模板DNA。最佳扩增反应程序：94℃变性5min，1个循环：94℃变性30s，52℃(46～56℃不定)退火45s，72℃延伸2min，40个循环；最后在72℃延伸5min， 1个循环。℃共对100条ISSR引物进行了筛选，分别筛选出扩增条带较多、信号强、背景清晰的10条ISSR引物用于5个居群DNA样本扩增，共扩增出76条带，其中多态性条带数为69个，多态性位点百分比为90.79％，以三清山居群的多态性位点百分比89.47％，安徽休宁居群的多态性百分比最低为56.58％。℃根据不同个体的扩增图构建了O、1矩阵(其中模糊带和弱带忽略不计)输入计算机。对ISSR．数据处理结果如下：POPGENE分析结果表明，华东黄杉具有丰富的遗传多样性，Nei’s基因多样性H=0.3361，Shannon's多态性指数I=0.4974。AMOVA分析表明，在总的遗传变异中有26.88％的变异发生在居群间，73.12％的变异发生在居群内。由LIPGMA聚类分析得知，5个居群中，湖南阳明山两支与浙江先聚为一支，再与安徽休宁聚为一支，最后与江西三清山聚合。 鉴于华东黄杉生境环境的特殊性和人为大量的砍伐，华东黄杉的数量逐渐减少，建议在华东黄杉分布区建立自然保护区，以江西三清山为核心地区，对其生存空间进行长期、有效的保护。另外，在居群间进行植株和幼苗的相互移栽，以提高居群间的基因交流，最大限度保护华东黄杉的遗传多样性。

目录

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第一章 引言

1.1保护生物学概述

1.2遗传多样性的研究

1.2.1遗传多样性的概念

1.2.2遗传多样性的研究内容及方法

1.2.3遗传多样性的研究意义

1.3DNA分子标记技术中几种常用技术的基本概念和特点

1.3.1RFLP技术

1.3.2RAPD技术

1.3.3AFLP技术

1.3.4SSR技术

1.3.5SNPs技术

1.3.6SRAP技术

1.4DNA分子标记技术在遗传学研究中的应用

1.4.1遗传多样性的研究

1.4.2品种亲缘关系及分类研究

1.4.3性别鉴定的研究

1.4.4种质鉴定及种质资源保护的研究

1.4.5构建分子标记遗传图谱及辅助树木育种的研究

1.4.6树木DNA指纹图谱的构建

1.5ISSR分子标记技术

1.6华东黄杉的研究意义及其分布

1.7华东黄杉当前的研究现状

第二章 材料与方法

2.1DNA的提取

2.1.1实验材料

2.1.2仪器与设备

2.1.3试剂和溶液

2.1.4改良的CTAB法

2.1.5基因组DNA琼脂糖凝较电泳的检测

2.1.6基因组DNA浓度测定和纯度检测

2.1.7CTAB法的优化

2.2ISSR分子标记对华东黄杉遗传多样性的分析

2.2.1实验材料

2.2.2实验仪器与试剂

2.2.3ISSR-PCR最佳反应体系的建立及优化

2.2.4随机引物的筛选

2.2.5PCR扩增产物的电泳分析

2.2.6数据统计和分析

第三章 结果与分析

3.1DNA的提取

3.1.1CTAB提取方法的优化

3.1.2基因组DNA凝胶电泳的检测

3.2ISSR分子标记对华东黄杉遗传多样性的分析

3.2.1ISSR-PCR最佳反应体系的建立及结果

3.2.2引物的筛选

3.2.35个居群89个个体的扩增结果

3.2.4三清山5个亚居群45个个体的扩增结果

第四章 结论与讨论

4.1DNA的提取

4.2PCR反应体系的建立和优化

4.3华东黄杉的遗传多样性及保护生物学分析

4.3.1华东黄杉的遗传多样性分析

4.3.2华东黄杉的遗传结构

4.3.3保护生物学意义

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果