细胞因子在雌小鼠内毒素攻击中的变化及其对卵母细胞成熟影响机理的研究

摘要

研究背景和研究思路 内毒素(endotoxin)是存在于革兰氏阴性菌外膜中的大分子脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)物质，是感染性休克的主要致病因子，而细胞因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha)、表皮生长因子(epidermal growthfactor,EGF)、内皮素-1(endothelin ET-1)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)等在介导或保护LPS引起的病理生理学变化中有着非常重要的作用。故而，阻断细胞因子引起的炎症级联反应，在防治内毒素攻击中具有重要的意义，然而至今尚未寻找到有效的内毒素拮抗剂。 雌性激素是存在于女性体内的正常激素，包括雌激素(以雌二醇一estradiol,E<,2>为代表)和孕激素(以孕酮—progesterone,P为代表)。 本研究工作分为四个部分： 第一部分探讨小鼠动情周期与脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)所致肝 肺组织病理损伤状态的关系及可能的机理；探讨动情周期不同阶段内毒素攻击 时卵巢中细胞因子含量的变化。 第二部分探讨不同剂量内毒素(3.0，6.0，12mg／kg)对PMSG和hCG诱导卵泡发育、成熟和排卵功能的影响和机理，以及E<,2>和P分别及联合应用时对内毒素影响卵泡发育、成熟和排卵功能的保护性作用。 第三部分用孕马血清促性腺激素(PMSG)诱导未成年小鼠超排卵，口吸管吸取卵丘一卵母细胞复合物(COC)以及裸卵(DO)，观察细胞因子对卵母细胞成熟的影响以及雌性激素的保护性作用。 第四部分用RT-PCR，western blot和显微注射方法观察细胞因子影响 卵母细胞成熟的机理以及原癌基因在介导细胞因子影响卵母细胞成熟中的作用。 本实验通过于动情周期不同阶段行LPS攻击，观察在体内不同E<，2>和P水平时LPS所致肝肺病理损伤的差异，并同步检测血浆和卵巢中的致炎因子(TNFa)及对机体有重要保护作用的表皮生长因子(EGF)变化，分析它们之间的相关关系，为进一步探讨雌性激素的保护作用及为临床上防治内毒素损伤提供依据。 1.实验动物及动情周期确定成年雌性昆明小白鼠，体重22-25g。用阴道涂片方法确定动情周期，选用处于动情期、动情后期和动情间期的小白鼠用于本实验。 2．实验分组 3.形态学观察动物处死后，留取肝、肺组织标本，按常规制片，HE染色，光镜观察。 4.逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)测定腹腔巨噬细胞和肝肺、卵巢组织中的TNFαmRNA表达总RNA提取 5．放射免疫法测定小鼠血浆和卵巢组织中EGF、TNF α、ET-1、E<,2>和P含量 按照放免试剂盒说明进行测定。 6．紫外分光比色法测定血浆和卵巢中的NO含量 按照试剂盒说明进行测定。 实验结论 动情期和动情后期高水平的E<,2>和P对LPS造成的组织损害有保护作用，其机理可能与降低TNFα、NO或／和ET-1产生和升高EGF产生有关。在内毒素攻击时，卵巢中细胞因子的水平也产生相应的变化。 目的和方法 雌性激素是存在于女性正常体内的激素，包括雌激素(以雌二醇E<,2>为代表)和孕激素(以孕酮P为代表)。E<,2>和P除对生殖系统有影响外，还对烧伤、创伤、感染等伤害性刺激造成的免疫系统、神经系统、心血管系统和消化系统等的功能紊乱和器质性损伤具有重要的调整和保护作用。内毒素是存在于革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中的脂多糖成分，是感染性休克的主要刺激物，也是各种严重损伤时由于肠源性感染、毒素移位等导致脓毒性休克、多功能脏器衰竭等的主要应激物。本研究旨在探讨：①内毒素应激时对卵巢的生卵和排卵功能的影响；②雌性激素对内毒素引响卵巢生殖功能的保护性作用。 1．实验设计 2.放射免疫检测小鼠血浆中雌二醇和孕酮含量按照放免试剂盒说明进行测定。 3.形态学观察动物处死后，留取卵巢组织，按常规制片，HE染色，光镜观察。 实验结论 内毒素能干扰小鼠的卵泡发育和排卵以及卵母细胞的成熟，此作用可能与抑制E<,2>和P产生有关；外源性E<,2>和P对内毒素抑制卵巢的生殖功能具有保护性作用。 第三部分 细胞因子对卵母细胞成熟的影响以及雌性激素的作用 目的和方法 从第一部分结果可见，在内毒素攻击时，机体的细胞因子产生变化并由之引起肝、肺等组织的病理性损伤，尤其是卵巢中细胞因子也产生明显的变化；从第二部分结果可见，在内毒素攻击时，卵泡发育和卵母细胞的成熟受到严重抑制。从中可以推测，内毒素引进的细胞因子尤卵巢中细胞因子的变化可能会对卵母细胞的成熟产生影响，但结果尚不清楚。本研究探讨上述细胞因子对卵母细胞成熟的确切作用，探讨雌性激素对细胞因子影响卵母细胞成熟的干预作用，为进一步了解卵母细胞的成熟机理增添新资料，为证实雌性激素对生殖功能的保护性作用提供实验依据。 1．实验动物模型和复合卵与的获取与培养3-4周龄健康雌性未成年昆明小白鼠，腹腔注射PMSG 8IU。 2．实验设计 实验1：观察小鼠卵母细胞在体外培养条件下的正常发育过程。以验证本培养系统的稳定性。 实验2：观察EGF对小鼠卵母细胞成熟影响的量效关系和时效关系。 实验3：观察TNF a对小鼠卵母细胞成熟影响的量效关系和时效关系以及E<,2>和P的作用。 实验4：观察ET-1对小鼠卵母细胞成熟影响的量效关系和时效关系以及E<,2>和P的作用。 实验5：观察NO对小鼠卵母细胞成熟影响的量效关系和时效关系以及E<,2>和P的作用。 3．卵母细胞成熟率的测定 以GVBD作为细胞核成熟的标志，PBl作用细胞质成熟的标志。 实验结论 卵母细胞的成熟受多种细胞因子的调节，其中EGF和TNFα可直接作用于裸卵，分别对卵母细胞的成熟起促进和抑制作用；ET-1对裸卵无明显影响，但能呈剂量和时间依赖方式抑制复合卵母细胞的成熟；小剂量NO供体硝普钠虽对复合卵母细胞的成熟无直接作用，但可反转dbcAMP和一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME对卵母细胞成熟的抑制作用，大剂量硝普钠则抑制复合卵母细胞的成熟。E<,2>和P对TNFα、ET-1和大剂量NO对卵母细胞的抑制作用具有保护效应，且似乎E<,2>更偏重于预防性作用，而P更偏重于治疗性作用。 第四部分 原癌基因在介导细胞因子影响 卵母细胞成熟中的作用 目的和方法 细胞因子调控卵母细胞成熟的机理尚不清楚。本研究探讨：①原癌基因c-erbB<,2>、c-myb在卵母细胞成熟中的作用及在介导细胞因子调控卵母细胞成熟中的作用；②在调控卵母细胞成熟中原癌基因在细胞因子和MAPK、MPF间是否起某种纽带作用；③E<,2>或／和P对细胞因子影响卵母细胞成熟的保护性作用是否与原癌基因有关。 6.实验设计 实验结论 原癌基因c-erbB<,2>、C-myb在卵母细胞成熟中起着重要的作用，可能是调控卵母细胞成熟中关键的蛋白激酶如MAPK、MPF的上游激活物，是介导细胞因子和MAPK、MPF间调控卵母细胞成熟的中间信号物质；雌二醇和孕酮对TNFα、ET-1、NO等细胞因子抑制卵母细胞成熟的作用与逆转卵母细胞中c-erbB<,2> mRNA、c-myb mRNA表达和MAPK磷酸化水平及cyclinB1含量下降有关。 全文总结 通过以上研究，我们得出如下结论： 1．小鼠处于动情期和动情后期其体内分别含有高水平的E2和P，对内毒素造成的肝、肺等组织的损害有保护性作用，保护性作用的机理可能与降低TNFα、NO或／和ET-1产生和升高EGF产生有关；内毒素攻击时也使卵巢中EGF、TNFα、NO、ET-1等产生相应的变化，尤其在动情间期使EGF明显下降，TNFα、NO和：ET-1明显上升。 2．内毒素能干扰小鼠的卵泡发育和排卵以及卵母细胞的成熟，此作用可能与抑制E<,2>和P产生有关；外源性E<,2>和P对内毒素抑制卵巢的生殖功能具有保护性作用。 3.卵母细胞的成熟受多种细胞因子的调节，其中EGF和TNFα可直接作用于裸卵，分别对卵母细胞的成熟起促进和抑制作用；ET-1对裸卵无明显影响，但能呈剂量和时间依赖方式抑制复合卵母细胞的成熟；小剂量NO供体硝普钠虽对复合卵母细胞的成熟无直接作用，但可反转dbcAMP和一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME对卵母细胞成熟的抑制作用，大剂量硝普钠则抑制复合卵母细胞的成熟。 4.用RT-PCR、western blot及显微注射等多种方法证实，原癌基因c-erbB<,2>、c-myb在卵母细胞成熟中起着重要的作用，可能是调控卵母细胞成熟中关键的蛋白激酶如MAPK、MPF的上游激活物，是介导细胞因子和MAPK、MPF间调控卵母细胞成熟的中间信号物质；雌二醇和孕酮对TNFα、ET-1、NO等细胞因子抑制卵母细胞成熟的作用与逆转卵母细胞中c-erbB<,2> mRNA、c-myb mRNA表达和MAPK磷酸化水平及cyclinB1含量下降有关。

目录

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略缩语表

前言

第一部分小鼠动情周期与脂多糖诱导细胞因子产生和肝肺组织病理变化关系的研究

第二部分内毒素对小鼠卵泡发育、成熟及排卵功能的影响以及雌性激素的保护性作用

第三部分细胞因子对卵母细胞成熟的影响以及雌性激素的作用

第四部分原癌基因在介导细胞因子影响卵母细胞成熟中的作用

参考文献

致谢

文献综述

攻读博士期间发表论文，承担的课题及获得的奖励