体外高甘油三酯状态下LPS对血管内皮细胞分泌功能的影响

摘要

目的：利用人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)原代培养的优化方法，成功构建脐静脉血管内皮细胞体外培养模型。在此基础上，以不同浓度的细菌内毒素(Lipopolyssacarides,LPS)和甘油三酯(Triglycerides，TG)共同干预受试细胞的生长，观察作用前后不同时间段靶细胞分泌肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)和内皮素(Endothelin，ET)的变化，并确立其转录调控分子水平的依据，从始动环节部分阐明心脑血管性疾病的致病机制，为研发拮抗内毒素药物和预防心脑血管疾病提供理论基础与实验依据。 方法：1．分别比较不同浓度的胰蛋白酶和胶原酶灌注脐静脉、灌注消化法和机械刮除法、不同pH值的培养液对细胞形态、数量等生长影响来优化细胞模型的构建，并从镜下形态观察和应用Ⅷ因子相关抗原免疫组化方法对获得细胞作出鉴定。2．原代细胞经稳定传代后取对数生长期的细胞作为受试细胞，用不同浓度的LPS和TG对受试细胞作用，在不同时间段收集细胞培养的上清液，分别应用<'125>I放射性核素标记TNF和ET的抗体，对所收集的标本进行放射免疫(RIA)定量分析，给出各组HUVEC培养液中TNF和ET含量。3．按照引物合成原则并利用相关合成软件分别设计TNF，ET引物，采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增FNF和ET的mRNA，产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，紫外透射仪上肉眼观察结果并摄影记录，同时采用凝胶分析软件测算各条带光密度值，进行分析比较。 结果：1.脐静脉内皮细胞原代培养时，采用0.1％胶原酶灌注消化12min，连续培养使用pH值7.4含小牛血清的RPMI 1640培养液明显优于其它细胞培养条件。2.倒置显微镜下观察细胞为单层生长，呈鹅卵石样镶嵌排列。免疫组织化学染色细胞内出现棕黄色颗粒，符合内皮细胞的Ⅷ因子抗原免疫组化特征表现。3.LPS和TG均能明显促进HUVEC分泌TNF、ET，其中lgg/mlLPS，10mmol/LTG作用24h达最大效应，各组与对照组相比存在显著性差异(p≤0.05)。4.lμg/ml的LPS分别和lmmol/L、5mmol/L、10mmol/L浓度的TG共同作用HUVEC，分泌INF和ET量大于单一因素刺激HUVEC分泌量，其中1μg/ml的L,PS和10mmol/LTG刺激24h作用最强，ET的分泌量达到784.6±7.3pg/ml，较10mmol/L,TG单独作用24h组、1μg/ml LPS单独作用24h组分泌量均增加2倍；TNF分泌量达到19.06±0.29ng/ml，较10mmol/L,TG单独作用24h组、1μg/mlLPS单独作用24h组分泌量分别增加4倍和3倍，与对照组相比存在显著性差异(p≤0.01)。5.RT-PCR显示1μg／mlLPS与不同浓度的TG共同刺激24h后，各组受试细胞mRNA在352bp和318bp处扩增条带亮度明显增强。软件分析结果经统计学处理，实验各组与对照组相比较，均有显著性差异(p＜0.05)。 结论：1．经过优化的原代培养，成功构建血管内皮细胞体外培养模型。2.LPS和TG均能单独诱导HUVEC分泌TNF和ET，与文献报道一致。3.LPS和TG共同作用HUVEC时，受试细胞分泌TNF和ET量较单一因素作用明显增高，提示LPS在TG引起心血管疾病中具有协同作用。4.RT-PCR结果进一步提示LPS这种协同作用是通过转录水平的mRNA表达上调来实现的。5减少LPS的吸收，降低血中LPS的常态含量，避免LPS的异常波动，同时控制体内TG的水平，有利于预防和治疗心脑血管性疾病；有效、准确地监测血中LPS或以TNF、ET作为监测指标，将对这类疾病的预防和疗效判断具有积极意义。

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综述 抗内毒素药物的研究进展