水稻Bel基因的克隆、表达特性分析及对烟草的转化

摘要

水稻品种8077S的苯达松敏感致死性是由单基因(bel)控制的，由于8077S在两系杂交稻制种中的应用前景使该基因的研究得到深入。本研究利用突变位点分析和生物信息学的方法证实bel基因即SNP51所在的基因，进一步克隆了Bel基因，利用半定量RT-PCR的方法研究了其表达特性；并将Bel构建入植物表达载体进行转基因烟草的分析，其主要结果如下： 1) 在前期研究对bel基因SSR和SNP精细定位的基础上，本研究对定位区段进行了候选基因的预测及其生物信息学分析，认为SNPl51所在基因即bel基因，它是由Bel基因单碱基确实突变造成的。 2) 对Bel基因的编码区cDNA进行了克隆，并将其构建到pMD18-T载体上进行了测序，NCBI Blast发现它是细胞色素P450基因家族CYP81A6基因，由两个外显子构成，编码了含513个氨基酸的膜结合蛋白质。 3) 以β-actin为内参，利用半定量RT-PCR技术对其表达特性进行了研究，发现Bel基因的表达受苯达松诱导调控，在苯达松处理后12 h表达量最大；Bel基因在不同的组织部位表达也存在差异，在叶中表达量最高。 4) 将．Bel基因从pMD18-T亚克隆至植物表达载体pKYL71，将pKYL71-Bel转化入农杆菌GV3101。利用GV3101进行烟草叶片的侵染并培育转基因烟草。PCR检测阳性克隆，苯达松处理发现转基因烟草获得了苯达松抗性。

目录

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第1章文献综述

1.1水稻苯达松敏感致死突变的研究

1.1.1选择性除草剂苯达松

1.1.2水稻苯达松敏感致死突变材料及其性状

1.1.3水稻苯达松敏感致死基因的遗传学研究

1.1.4水稻苯达松敏感致死基因的分子标记定位及相关研究

1.1.5水稻对苯达松的解毒过程及苯达松敏感致死的分子机理

1.2 P450与除草剂抗性植物

1.2.1 P450的概述

1.2.2 P450与除草剂代谢

第2章材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.2.1水稻Bel基因的克隆及序列分析

2.2.2半定量RT-PCR研究Bel表达的特性

2.2.3水稻Bel基因的转基因烟草构建与分析

第3章结果与分析

3.1利用生物信息学手段对BEL基因的分析

3.1.1 Bel区段的基因预测

3.1.2Bel基因结构的分析

3.1.3保守性结构域、其序，蛋白质家庭分析

3.2 BEL基因的克隆

3.2.1水稻DNA及RNA的提取

3.2.2 Bel基因编码区(CDS)的克隆

3.2.3 T载体连接转化及序列分析

3.2.4 Bel基因与其它具有除草剂抗性的P450基因的序列分析

3.3 BEL基因表达特性的研究

3.3.1半定量RT-PCR指数扩增循环次数的确定

3.3.2 Bel基因表达特性研究

3.4 BEL基因的烟草转基因研究

3.4.1表达载体pKYL71-Bel的构建

3.4.2转基因烟草的培育

3.4.3转基因烟草的PCR鉴定

3.4.4转基因烟草的苯达松检测

第4章讨论

4.1 BEL基因突变的分子机理的分析

4.2定量RT-PCR的思考

4.3 BEL基因与抗除草剂P450

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果