产纤维素酶菌株的鉴定、诱变育种、发酵产酶条件及酶学性质研究

摘要

本实验从稻田土壤、朽木，牛粪中分离到三类产纤维素酶菌株，经菌落形态观察、显微形态观察、生理生化形态观察，初步鉴定为：第一组，NC-1菌株、NC-2 菌株、NC-4 菌株、NC-6 菌株，这四株菌为青霉属中的常见青霉组(P.frequentans)；第二组，NC-3菌株、NC-5菌株、NC-9菌株，这三株菌为枝孢属枝状枝孢(Cladosporium．cladosporioides)；第三组，NC-7菌株、NC-8 菌株，这两株菌为链霉菌属中的生二链霉菌 (Streptomyces．ambofaciens)。 枝孢菌NC-5经UV、DES、UV和DES处理后，发现以70sUV和75minDES复合诱变为佳，该剂量下致死率为88.93％，正变率为15.16％。诱变筛选到突变株 L-5，其 CMC 酶活提高14.92％，FPA酶活提高28.57％。青霉菌NC-2经UV、DES、UV和DES处理后，发现以UV照射90s为佳，该剂量下致死率为 97.89％，正变率为7.35％。诱变筛选到突变株L-2，其CMC酶活提高10.47％，FPA 酶活提高19.54％。生二素链霉菌NC-7经UV、DES、UV和DES处理后，发现以DES处理60min、再经UV照射70s，或DES处理60min、再经UV照射80s复合诱变效果较好。多次重复实验后，得到二株CMC酶活和FPA酶活都显著提高的菌株，分别是X402菌株和P303菌株。X402菌株、P303 菌株比出发菌NC-7菌株的 CMC 酶活分别提高 13.21％和23.92％，FPA．酶活分别提高38.95％、22.44％。 对生二素链霉菌P303发酵产酶培养基进行优化，得到最适产酶培养基，最佳混合碳源稻草粉/麸皮的添加比例为3:1，最佳混合氮源尿素/NH<,4>Cl的添加比例为3:1。最佳接种量为10.0％，最佳装液量为60ml/250ml，产酶最适pH为5.0～6.0，产酶最适培养温度为37℃，在35～39℃内稳定。培养120h时CMC酶活和滤纸酶活达到高峰，但是培养144 h时β-葡萄糖苷酶活达最高。生二素链霉菌P303菌株经发酵条件优化后，它的CMC酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶三种酶活性分别为 7.76IU/ml、3.57IU/ml和4.03IU/ml，比原始初筛的NC-7 菌株分别提高了 81.73％、363.64％、96.59％。说明该菌产生的纤维素酶系有较高的β-葡萄糖苷酶活和滤纸酶活。 生二素链霉菌P303菌株生产的纤维素酶反应的最佳条件：CMC酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶的最适酶解温度分别为 60℃、60℃、65℃，最适酶解pH 分别为 7.0、7.0和8.0，酶促反应时间以 30min 较理想。Ca<'2+>、Zn<'2+>、Co<'2+>对 CMC 酶、β-葡萄糖苷酶、滤纸酶有较强的激活作用，Mg<'2+>、Cu<'2+>对CMC酶、β-葡萄糖苷酶、滤纸酶有弱抑制活性，Mn<'2+>对CMC酶、β-葡萄糖苷酶有有弱抑制活性，但对滤纸酶有较强的激活作用，Fe<'3+>对纤维素酶影响不大。CMC 酶在低于70℃时稳定性很好，β-葡萄糖苷酶低于65℃时稳定性很好，滤纸酶低于70℃时稳定性很好。CMC 酶在 pH 6.0-9.0 范围内比较稳定，β-葡萄糖苷酶在 pH 6.0-10.0范围内比较稳定，滤纸酶在 pH 7.0-11.0 范围内比较稳定。说明生二素链霉菌P303的纤维素酶是高温碱性酶，在高温碱性条件下能保持较高的酶活力。以上的实验及设计，为纤维素酶的工业化生产提供了重要依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第1章绪论

1.1纤维素酶体系

1.2纤维素酶分子结构及作用机理

1.2.1纤维素酶对纤维素分子的吸附作用

1.2.2纤维素酶中单个组分的作用机制

1.2.3天然纤维素的微生物降解理论

1.2.4纤维素酶的协同降解作用

1.3纤维素酶的酶活测定

1.3.1内切型β-1-4-葡聚糖酶(CMC酶)活力的测定方法

1.3.2纤维二糖酶(CBH)活力的测定方法内切型

1.3.3滤纸酶活(FPA)活力的测定方法

1.3.4产纤维素酶的微生物

1.5国内外纤维素酶放线菌的测定

1.6纤维素酶菌种的诱变选育

1.6.1常规理化诱变技术育种

1.6.2基因克隆技术育种

1.6.3细胞融合技术育种

1.7碱性纤维素酶的研究进况

1.7.1碱性纤维素酶的特点

1.7.2碱性纤维素酶的去污机理

1.8纤维素酶的应用

1.8.1纤维素酶在食品工业中的应用

1.8.2纤维素酶在发酵工业中的应用

1.8.3纤维素酶在在饲料工业中的应用

1.8.4纤维素酶在纺织业中的应用

1.8.5纤维素酶在能源方面的应用

1.9纤维素酶的研究热点

1.9.1碱性纤维素酶的研究

1.9.2放线菌纤维素酶的研究

1.9.3混菌发酵生产纤维素酶的研究

1.9.4纤维素酶作用机制的研究

1.10本课题的主要内容

第2章产纤维素酶菌株的筛选和鉴定

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果与讨论

2.2.1筛选结果

2.2.2鉴定结果

2.3小结

第3章产纤维素酶菌株的诱变

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果与讨论

3.2.1诱变结果

3.2.2遗传稳定性试验

3.3小结

第4章生二素链霉菌P303发酵产纤维素酶条件的研究

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与讨论

4.2.1葡萄糖标准曲线的测定结果

4.2.2培养基组成对纤维素酶系酶活力的影响

4.2.3培养条件对纤维素酶系酶活力的影响

4.2.4生二素链霉菌纤维素酶不同酶系的酶活比较

4.3小结

第5章生二素链霉菌P303的纤维素酶酶学性质研究

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果与分析

5.2.1纤维素酶最适反应条件的研究

5.2.2金属离子对纤维素酶酶活的影响

5.2.3纤维素酶稳定性研究

5.3小结

第6章结论与展望

6.1产纤维素酶菌株的分离鉴定

6.2产纤维素酶菌株的诱变

6.3生二素链霉菌P303菌株的发酵产纤维素酶条件

6.4生二素链霉菌P303菌株纤维素酶的酶学性质

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果