龙牙百合脱毒种球培育及休眠生理的研究

摘要

龙牙百合(Lilium brownii var．viridulum Baker)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生草本值物，其食用部分是地下鳞茎，药食同源，有较高的营养价值和保健作用。百合病毒病是造成品种退化、产量降低、品质下降的主要原因之一，目前尚无有效药剂防治病毒病，最方便可靠的措施是通过茎尖培养，生产脱毒种球。龙牙百合具有休眠的特性，在以鳞茎作种球进行大田生产时，休眠程度影响着田间出苗的早晚、出苗率、整齐度、植株的长势和产量等；在以鳞茎作加工原料时，休眠的解除又会造成水分和养分的大量消耗，以至于丧失应用价值。因此，开展本项目的研究，对鳞茎的储藏保鲜、加工和脱毒种球的生产、推广应用等均具有十分重要的意义。 以龙牙百合鳞茎为材料，采用植物组织培养技术研究了高温、病毒化学抑制剂等预处理对其茎尖存活率和脱毒效果的影响以及脱毒鳞茎J陕速繁殖的途径。采用分光光度法、高效液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、IEF-SDS双向电泳、细胞化学和透射电子显微镜等技术，研究了低温贮藏解除休眠过程中碳水化合物、蛋白质、核酸、内源激素等含量和同工酶、蛋白质组分、Ca<'2+>-ATPase分布以及茎尖超微结构的动态变化。 结果表明：茎尖分生组织的大小与脱毒率呈负相关，高温对病毒的抑制作用依次为CMV、LRV、TBV、LSV；一定浓度的病毒唑可有效的使病毒钝化，提高脱毒率，小苗的茎尖较小鳞茎的茎尖容易去除病毒，2种或3种脱毒技术的组合是生产龙牙百合脱毒种球的首选方法。龙牙百合体细胞胚发生的重要调节因素是2，4-D，其形态学发育过程与合子胚相似，依次经过球形胚，心形胚，鱼雷胚，成熟胚等阶段，形成再生植株。在低温贮藏过程中，鳞茎的淀粉含量呈逐渐下降的变化，而可溶性糖和可溶性蛋白含量则呈明显上升趋势，淀粉分解产生的糖类为鳞茎解除休眠及萌发后茎尖的生长发育提供了物质和能量基础；RNA含量呈抛物线的变化趋势，而DNA含量变化不明显。GA<,3>与IAA含量以及GA<,3>/ABA、IAA/ABA的比值呈明显上升趋势，ABA含量总体呈下降趋势，内源激素的变化和平衡与休眠解除有关，休眠的解除可能为GA<,3>类促进物质和ABA类抑制物质相互作用所致。鳞叶中过氧化物酶(POD)同工酶酶带较多，且在40 d后陆续有新的条带出现；淀粉磷酸化酶(PHO)同工酶条带较少，只在第60 d有一新条带的出现；酯酶(EST)同工酶在第30 d后有新的条带出现，且活性也逐渐增强，表明休眠的解除过程一直伴随着新同工酶的出现和活性强弱的变化。鳞茎低分子量蛋白含量丰富，21kD和23kD两个蛋白组分表达优势明显，是其主要的蛋白组分，检测到3类低温贮藏过程中变化的蛋白(多肽)，其中有—类是新出现的多肽，说明休眠的解除不但有蛋白质表达丰度强弱的变化，更有新蛋白的参与。生长点线粒体膜和质膜匕的Ca<'2+>-ATPase活性分别在第30 d时和第40 d时达最高，而液泡膜上的只在第50 d时才出现，核仁和染色质部位的ca<'2+>-ATPase活性在细胞分裂时最高；30 d时可观察到细胞核体积增大，线粒体数量及内部的管泡状嵴以及脂体和内质网增多，液泡由大逐渐裂解成数量较多的小液泡，造粉质体向前质体逐渐转变，这些Ca<'2+>-ATPase时空分布和超微结构规律性的变化，可作为形态学上解除休眠开始的指标。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第1章 引言

1.1概述

1.2国内外研究背景

1.3研究方法和实验设计

第2章 文献综述

2.1百合病害及脱毒技术研究

2.1.1百合病害类型

2.1.2百合脱毒技术研究

2.1.3百合病毒检测技术

2.2百合组织培养

2.2.1外植体

2.2.2培养基

2.2.3继代培养与植株再生

2.3有关植物休眠与萌发机理的几种假说

2.3.1激素调控学说

2.3.2代谢途径调控学说

2.3.3代谢物的调控

2.3.4基因表达的调节

2.4百合休眠的原因

2.5休眠的解除方法

2.6解除百合鳞茎休眠过程中的变化

2.6.1茎尖的形态变化

2.6.2茎尖超微结构的变化

2.6.3 Ca2+和Ca2+-ATPase的变化

2.6.4碳水化合物代谢的变化

2.6.5蛋白质代谢的变化

2.6.6核酸代谢的变化

2.6.7内源激素的变化

2.7前景与展望

第3章 龙牙百合脱毒技术的研究

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果与分析

3.2.1不同外植体的茎尖大小对成活率的影响

3.2.2高温预处理对脱毒效果的影响

3.2.3化学预处理对脱毒效果的影响

3.3讨论

3.3.1茎尖大小来源与成活率、脱毒率之间的关系

3.3.2热处理对脱毒效果的影响

3.3.3病毒化学抑制剂对脱毒效果的影响

3.3.4病毒检测方法

第4章 脱毒小鳞茎增殖培养技术

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与分析

4.2.1鳞叶直接诱导次级小鳞茎

4.2.2小鳞茎的增殖

4.2.3小鳞茎诱导丛生芽

4.2.4脱毒小鳞茎生根试验结果

4.3讨论

4.3.1鳞叶诱导次级小鳞茎

4.3.2小鳞茎的增殖

4.3.3丛生芽的诱导

第5章 脱毒龙牙百合体细胞胚的诱导及植株再生

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果与分析

5.2.1体细胞胚的诱导条件

5.2.2形态学观察结果

5.3讨论

5.3.1 2,4-D浓度对诱导体细胞胚的影响

5.3.2体细胞胚的发生途径和发育过程

第6章 低温贮藏解除休眠过程中生理生化指标的变化

6.1材料与方法

6.1.1供试材料

6.1.2方法

6.2结果与分析

6.2.1淀粉含量的变化

6.2.2可溶性糖含量的变化

6.2.3可溶性蛋白含量的变化

6.2.4过氧化物酶(POD)同工酶电泳

6.2.5淀粉磷酸化酶(PHO)同工酶电泳

6.2.6酯酶(EST)同工酶

6.3讨论

6.3.1碳水化合物的变化和休眠解除的关系

6.3.2可溶性蛋白质的变化和休眠解除的关系

6.3.3同工酶的变化和休H民解除的关系

第7章 龙牙百合贮藏期间内源激素的变化

7.1材料与方法

7.1.1实验材料

7.1.2仪器和试剂

7.1.3激素的提取、纯化和测定

7.2结果与分析

7.2.1ABA

7.2.2GA3

7.2.3IAA

7.2.4商品鳞茎GA3/ABA、IAA/ABA比值的变化

7.2.5试管鳞茎GA3/ABA、IAA/ABA比值的变化

7.3讨论

7.3.1内源激素的动态变化与休眠解除的关系

7.3.2激素平衡与休眠解除的关系

第8章 低温解除休眠茎尖结构及Ca2+-ATPase分布变化

8.1材料与方法

8.1.1材料

8.1.2方法

8.2结果与分析

8.2.1显微结构的变化

8.2.2超微结构的变化

8.2.3低温贮藏过程小鳞茎生长点Ca2+-ATPase的分布

8.2.4不同温度贮藏下试管鳞茎的萌发率

8.3讨论

8.3.1茎尖显微结构的变化与休眠解除的关系

8.3.2茎尖细胞中线粒体的变化与休眠解除的关系

8.3.3茎尖细胞中液泡的变化与休眠解除的关系

8.3.4茎尖细胞中质体的变化与休眠解除的关系

8.3.5茎尖细胞中脂体的变化与休眠解除的关系

8.3.6茎尖细胞中内质网、高尔基体的变化与休眠解除的关系

8.3.7生长点Ca2+-ATPase的时空分布与休眠解除的关系

第9章 低温解除休眠过程中蛋白质组分和核酸含量的变化

9.1材料与方法

9.1.1材料

9.1.2方法

9.2结果与分析

9.2.1SDS-PAGE单向电泳分析

9.2.2IEF-SDS-PAGE双向电泳分析

9.2.3核酸含量的动态变化

9.3讨论

9.3.1双向电泳方法的优化

9.3.2电泳图谱的软件分析

9.3.3蛋白的质谱鉴定

9.3.4蛋白质组分与休眠解除的关系

9.3.5核酸含量与休眠解除的关系

第10章 结论与展望

10.1结论

10.2创新点

10.3进一步工作的方向

致谢

参考文献

附录：图版1

附录：图版2

附录：图版3

攻读学位期间的研究成果