环介导等温扩增技术在下呼吸道感染病原菌诊断上的应用

摘要

目的：建立一种运用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术检测和鉴定常见下呼吸道感染病原菌的方法，以提高临床检测病原菌的速度及准确性。证实其在诊断上的应用价值。 方法：1.确定常见下呼吸道感染11种病原菌：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体；2.通过BLAST、Align X和Primer 5.0程序，对各病原菌菌株的基因保守区进行序列分析，设计并合成本试验所需的引物；3.收集我院诊断为下呼吸道感染的50例患者痰标本；提取各标本中病原体DNA;4.将提取的DNA进行环介导等温扩增技术扩增，放入实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)仪65℃反应45分钟，行荧光方法检测，测定熔解曲线，进行数据分析；5.对检测体系的灵敏度和特异性进行测试；6.利用该检测方法对50例临床诊断为下呼吸道感染的痰标本进行LAMP法检测，与传统的痰常规细菌培养法进行比较分析。 结果：1.病原菌的检测灵敏度均可以达到200copies/25ul反应体系(相当于1.7×104copies/ml痰液)；2.每种菌株的引物只与其相应的细菌DNA反应，而与下呼吸道感染常见11种病原菌无交叉反应，表明探针具有较高的特异性；3.LAMP检测的阳性率为82.0％，较常规细菌培养的阳性率高；4.LAMP技术能检测出多数浓度较低的样品细菌或者难培养的细菌。 结论：本研究初步建立的下呼吸道感染病原菌LAMP技术能够准确、敏感、快速、高效地检测痰标本中的病原菌，为进一步完善和建立下呼吸道感染病原菌的LAMP基因芯片检测技术打下了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章引言

第2章材料与方法

2.1主要实验仪器和器材

2.2主要试剂

2.3检测病原菌的确定

2.4实验对象

2.5痰标本的处理与保存

2.5.1痰标本的处理

2.5.2标本保存

2.6病原菌LAMP引物的设计与合成

2.7痰样品细菌核酸提取

2.8痰样品核酸LAMP反应流程

2.9方法的灵敏度与特异性检测

2.9.1灵敏度测定

2.9.2特异性测定

2.10痰标本的常规细菌培养检测

2.11统计学处理

第3章结果

3.1 LAMP技术的灵敏度

3.2 LAMP技术的特异性

3.3 LAMP方法检测和痰标本常规细菌学检测结果的比较

3.3.1 LAMP法和常规培养法细菌检测阳性率

3.3.2 LAMP法检出多种复合菌感染

3.3.3 LAMP法检测出非典型病原菌

第4章讨论

4.1 LAMP技术

4.2 LAMP技术在病原菌检测中的应用

4.3 LAMP技术的灵敏度、特异性

第5章结论

致谢

参考文献

综述 环介导等温扩增技术在下呼吸道感染病原学诊断上的应用

攻读学位期间的研究成果