C-erbB蛋白在小鼠围着床期子宫中的表达及其对体外胚胎着床影响的研究

摘要

目的：探索C-erbB2蛋白在小鼠围着床期子宫组织中的表达与定位；研究小鼠子宫内膜上皮(endometrial epithelial cells EECs)细胞的分离、鉴定和体外培养技术；建立小鼠体外胚胎着床的模型和共培养体系；初步探讨c-erbB2反义寡核苷酸(c-erbB2 ASODN)对小鼠体外胚胎着床的影响。 方法： 1、用促超排法制作妊娠小鼠的动物模型； 2、用免疫组化法观察C-erbB2蛋白在围着床期小鼠子宫组织中的表达与定位； 3、用分步酶消化法分离培养EECs，并用抗细胞角蛋白(CK-19)免疫细胞化学方法鉴定EECs； 4、将己贴壁的EECs与获取的小鼠胚泡进行共培养以建立小鼠体外胚胎着床模型，分组观察比较胚泡在不同培养体系中的脱带率、粘附率、扩展率，确定理想的共培养体系； 5、分组观察比较c-erbB2 ASODN对小鼠体外胚胎着床的影响； 6、用western blotting法检测各组EECs中C-erbB2蛋白的表达情况。 结果： 1、免疫组化结果显示在未孕子宫和空白对照组子宫中未见C-erbB2蛋白的表达，D1-3天子宫中C-erbB2蛋白主要分布在子宫内膜腔上皮和腺上皮细胞胞膜上，子宫基质细胞中未见表达，D4-5天子宫中C-erbB2蛋白除了表达在子宫内膜腔上皮和腺上皮细胞胞膜上，上皮下基质细胞膜上可见弱阳性表达，D6-8天的子宫中C-erbB2蛋白主要分布在子宫内膜腔上皮和腺上皮细胞以及围绕着床位点的蜕膜细胞胞膜上，各组肌层均未见阳性表达； 2、分步酶消化法成功分离培养EECs，用抗CK-19免疫细胞化学染色鉴定EECs，其阳性率达到90％以上； 3、三组共培养组(无血清共培养、3％FBS共培养组、0.4％BSA共培养组)的脱带率、粘附率和扩展率明显高于胚泡单独培养组(P<0.05)，3％FBS共培养组和0.4％BSA共培养组的脱带率、粘附率和扩展率又明显高于无血清共培养组(P<0.05)，而3％FBS共培养组的脱带率、粘附率、扩展率和0.4％BSA共培养组相比，差别无显著性(P>0.05)； 4、用c-erbB2 ASODN干预着床模型结果显示：各组24小时脱带率差别无统计学意义(P>0.05)；51μmol/L c-erbB2 ASODN组48小时粘附率与扩展率低于对照组，但差别无统计学意义(P>0.05)，10μmol/Lc-erbB2 ASODN组48小时粘附率与扩展率明显低于对照组，差别有统计学意义(P<0.05)，15、20μmol/L c-erbB2 ASODN组48小时粘附率与扩展率显著低于对照组，差别有显著统计学意义(P<0.01)，而20μmol/L c-erbB2 ODN组48小时的粘附率和扩展率与对照组相比无差别(P>0.05)； 5、Western Blotting法检测c-erbB2 ASODN各组EECs中C-erbB2蛋白表达结果显示：不同浓度的c-erbB2ASODN作用着床模型48小时后，5gmol/L c-erbB2 ASODN组蛋白的表达低于对照组，但差别无统计学意义(P>0.05)，10μmol/L c-erbB2 ASODN组表达明显低于对照组，差别有统计学意义(P<0.05)，15、20μmol/L c-erbB2 ASODN组蛋白的表达显著低于对照组，差别有显著统计学意义(P<0.01)；另外，20μmol/Lc-erbB2 ASODN作用24小时后C-erbB2蛋白表达低于对照组(P<0.05)，20μmol/Lc-erbB2 ASODN作用48小时后C-erbB2蛋白表达显著低于对照组(P<0.01)。 结论： 1、C-erbB2蛋白在着床期小鼠子宫组织中表达有规律性变化； 2、分步酶消化法是分离培养子宫内膜上皮细胞的有效方法： 3、胚泡与EECs共培养是比较理想的着床模型，3％FBS和0.4％BSA都是比较理想的共培养体系； 4、C-erbB2蛋白能促进小鼠胚胎的体外着床。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略语

声明

第1章引 言

第2章材料和方法

2.1材料

2.1.1实验动物

2.1.2主要试剂和液体的配制

2.1.3主要仪器

2.2方法

2.2.1动物模型的制备

2.2.2免疫组化C-erbB2蛋白在围着床期子宫组织中的表达

2.2.3子宫内膜上皮细胞的分离与鉴定

2.2.4小鼠体外胚胎着床模型的建立

2.2.5 c-erbB2 ASODN对小鼠体外胚胎着床的影响

2.2.6 Western Blotting检测C-erbB2蛋白表达

2.3统计处理

第3章结果

3.1子宫内膜上皮细胞的分离和鉴定结果

3.1.1子宫内膜上皮细胞的培养及生长情况

3.1.2子宫内膜上皮细胞的鉴定结果

3.2小鼠体外胚胎着床模型的建立结果

3.2.1不同培养体系对小鼠胚胎脱带率的影响

3.2.2不同培养体系对小鼠胚胎的粘附率的影响

3.3.3不同培养体系对扩展率的影响

3.3 C-erbB2蛋白在小鼠围着床期子宫组织中的表达与定位

3.4 c-erbB2 ASODN对小鼠子宫内膜上皮细胞C-erbB2蛋白表达的影响

3.4.1 c-erbB2 ASODN抑制C-erbB2蛋白的量-效关系

3.4.2 c-erbB2 ASODN抑制C-erbB2蛋白的时-效关系

3.5 c-erbB2 ASODN对体外胚胎着床的影响

3.5.1不同浓度的c-erbB2 ASODN对小鼠胚胎脱带率的影响

3.5.2不同浓度的c-erbB2 ASODN对小鼠胚胎粘附率的影响

3.5.3不同浓度的c-erbB2 ASODN对小鼠胚胎扩展率的影响

第4章讨论

4.1小鼠体外胚胎着床模型的建立

4.2 C-erbB2蛋白在小鼠围着床期子宫组织中的表达与定位

4.3 c-erbB2 ASODN对小鼠体外胚胎着床的影响

第5章结论

致 谢

参考文献

综述 子宫内膜细胞培养方法的研究

攻读学位期间研究成果