耐受性树突状细胞对免疫介导性再生障碍性贫血小鼠骨髓造血功能的影响

摘要

目的：筛选耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells，tDCs)的体外培养方法，探索其对免疫介导性再生障碍性贫血模型小鼠造血功能的影响，为tDCs治疗再生障碍性贫血的临床应用提供理论依据。 方法：采用雌性Balb/c小鼠为供体，雌性昆明小鼠为受体。取供体小鼠骨髓细胞，分离单个核细胞。在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中加入不同因子组合分为五组进行体外诱导培养：空白组(不加任何因子)、常规DCs组(GM—CSF100ng/ml+IL-4100ng/ml)、VD1-DCs 组(GM-CSF20ng/ml+VIP40ng/ml+DXM10ng/ml)、VD2-DCs组(GM-CSF20ng/ml+VIP40ng/ml+DXM50ng/ml)、VD3-DCs组(GM-CSF20ng/ml+VIP40ng/ml+DXM100ng/ml)。光镜下动态观察细胞形态，流式细胞术检测细胞CD80、CD86、CD40、CD11c表达，MTT法检测DCs刺激淋巴细胞增殖活性。40只受体小鼠分为正常对照组、模型组、tDCs组、单纯照射组。模型组：昆明小鼠经X射线亚致死量(7Gy)全身均匀照射后，于4小时内自尾静脉输入Balb/c小鼠的胸腺淋巴结细胞1X106只。tDCs组：制模后第3天、第5天分别输注tDCs1×106/只。动态观察小鼠外周血白细胞变化，小鼠濒死时(或制模后第28天)，取股骨行骨髓病理切片观察，计数单侧骨髓有核细胞数，甲基纤维素半固体培养法测定CFU-GM集落数，流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD8+T细胞、CD4+CD25+T细胞的表达。 结果： 1、利用GM-CSF、IL-4、VIP、DXM、LPS等因子体外培养能诱导生成具有典型树枝状突起的DCs。常规DCs组、VD1-DCs组、VD2-DCs组、VD3-DCs组CD11c的表达较高，与空白组比较有显著性差异(P＜0.05)。 2、VD1-DCs组、VD2-DCs组、VD3-DCs组CD40、CD80、CD86表达和淋巴细胞增殖活性均低于常规DCs组(P＜0.05)，其中VD1-DCs组(VIP浓度为40ng/ml、DXM为10ng/ml)最低，差异最明显。 3、再生障碍性贫血模型组小鼠外周血白细胞数持续下降，制模后第28天生存率10％，单侧股骨骨髓有核细胞数及CFU-GM集落数明显减少，与tDCs组、单纯照射组相比有明显差异(P＜0.05)。骨髓病理切片显示：骨髓增生极度低下，造血细胞极度减少，大量脂肪细胞填充骨髓腔。脾淋巴细胞CD8+T细胞的表达明显升高，CD4+CD25+T细胞的表达明显降低，与tDCs组、正常对照组相比有明显差异(P＜0.05)。 4、tDCs组小鼠在制模后白细胞数有所下降，第10天下降至低点(1.52×109/L)，此后逐渐恢复至正常。制模后第28天生存率70％。tDCs组单侧股骨骨髓有核细胞数及CFU-GM集落数与正常对照组、单纯照射组无明显差异(P＞0.05)，与模型组比较差异明显(P＜0.05)。骨髓病理切片示骨髓增生活跃，脂肪细胞较少，与正常对照组相似。tDCs组小鼠脾淋巴细胞CD4+CD25+T细胞的表达明显升高，与模型组比较有明显差异(P＜0.05)。 结论： 1.小鼠骨髓单个核细胞，体外经GM-CSF、VIP、DXM、LPS联合诱导培养生成耐受性树突状细胞(tDCs)，其中VIP40ng/ml联合DXM10ng/ml的培养条件最佳。 2.小鼠经X射线7Gy全身均匀照射后，于4小时内自尾静脉输入供体小鼠的胸腺淋巴结细胞1×106/只，能较好的制备免疫介导性再生障碍性贫血小鼠模型。 3.体外培养的tDCs输入免疫介导性再生障碍性贫血小鼠体内，可诱导CD4+CD25+调节性T细胞生成，促进小鼠造血功能的恢复。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引言

第二章材料与方法

2.1主要仪器与材料

2.1.1实验动物

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.2实验方法

2.2.1标本来源

2.2.2骨髓单个核细胞分离

2.2.3细胞培养

2.2.4树突状细胞表型分析

2.2.5树突状细胞刺激淋巴细胞增殖活性测定

2.2.6实验分组

2.2.7免疫介导性再生障碍性贫血小鼠模型的建立

2.2.8小鼠外周血白细胞检测

2.2.9甲基纤维素半固体培养基的制备

2.2.10小鼠骨髓有核细胞数及CFU-GM集落培养计数

2.2.11小鼠骨髓病理切片

2.2.12小鼠脾细胞免疫分型

2.2.13数据统计学处理

第三章结果

3.1培养的耐受性树突状细胞的光镜观察

3.2不同条件培养组DCs表面标志变化

3.3混合淋巴细胞反应

3.4 tDCs对免疫介导性再生障碍性贫血小鼠生存的影响

3.5小鼠外周血白细胞数

3.6小鼠骨髓有核细胞数及CFU-GM集落数

3.7小鼠骨髓病理切片

3.8小鼠脾细胞免疫分型

第四章讨论

4.1免疫介导性再生障碍性贫血小鼠模型的建立

4.2 tDCs取材来源和体外培养方法

4.3体外培养的tDCs诱导CD4+CD25+T细胞的产生

4.4 tDCs在免疫介导性再生障碍性贫血中的应用

第五章结论

致谢

参考文献

综述耐受性树突状细胞与自身免疫性疾病关系

攻读学位期间发表文章