Ⅰ标记HER2高亲和力模拟肽对乳腺癌细胞的靶向杀伤作用

摘要

目的：用放射性同位素131I标记HER2高亲和力模拟肽B2-S22-AFA，选用乳腺癌HER2高表达细胞株SKBR3及HER2低表达细胞株MDA-MB-231作为对照，观察131I标记B2-S22-AFA与乳腺癌细胞HER2受体的结合能力及其对乳腺癌细胞的靶向杀伤能力，为高表达HER2的乳腺癌及其它肿瘤的放射性靶向治疗研究提供依据。 方法：1.收集体外培养的对数生长期的人乳腺癌细胞SKBR3和MDA-MB-231，用细胞裂解液裂解细胞，考马斯亮蓝染色法测定细胞总蛋白含量，蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测SKBR3、MDA-MB-231细胞表面HER2受体蛋白表达水平。2.MTT法观察B2-S22-AFA在不同浓度EGF作用下对SKBR3、MDA-MB-231细胞生长的抑制作用，选择合适的EGF浓度作为后继实验条件。3.溴代琥珀酰亚胺(NBS)法进行131I标记B2-S22-AFA，三氯醋酸法测定反应物标记率，Sephadex G-25 凝胶层析柱过滤纯化、以恒定速度连续收集洗脱液，测定每管放射性。以每管的放射性活度对管次作图，得到131I标记模拟肽的洗脱图，收集蛋白峰各管标记物进行产品质量鉴定，包括放化纯度、放射性比活度及免疫活性，并进行稳定性实验。4.细胞结合实验：取等量131I标记的B2-S22-AFA，加入至过量的乳腺癌细胞SKBR3、MDA-MB-231中，分别测定标记物与2种细胞的结合率。5.在EGF促进细胞增殖的条件下，活细胞计数法观察131I标记B2-S22-AFA对SKBR3、MDA-MB-231细胞的杀伤作用。 结果：1.Western Blot检测结果显示：HER2受体蛋白在SKBR3呈强阳性表达，条带明显；在MDA-MB-231无条带出现，为低表达。2.不同浓度EGF对乳腺癌细胞SKBR3、MDA-MB-231生长的促进作用不同，浓度越高，促生长作用越明显；相同浓度的EGF对SKBR3的促进作用明显强于MDA-MB-231；48h以上的促生长作用较明显。3.B2-S22-AFA对HER2高表达的SKBR3细胞的生长有明显抑制作用，抑制率可达(30.3±3.5)％，对HER2低表达的MDA-MB-231细胞的生长无明显抑制作用。4.NBS法对B2-S22-AFA进行131I标记，标记率为64.8％～69.6％，经凝胶过滤纯化后得到明显的双峰曲线，其蛋白峰高尖窄，盐峰低平，未见损伤峰和聚合峰出现。标记后模拟肽的放射化学纯度高于95％，稳定性较好，37℃放置24h、48h、72h放化纯度分别为86.3％、77.4％、65.8％。 5.131Ⅰ标记B2-S22-AFA与SKBR3的结合率明显高于与MDA-MB-231的结合率，前者接近后者的十倍。6.131Ⅰ标记B2-S22-AFA在加入后48 h对细胞的抑制作用最强，对HER2高表达的SKBR3细胞的抑制率为(51.2±3.0)％，明显高于HER2低表达的乳腺癌细胞MDA-MB-231及其它实验组(P＜0.05)。 结论： 1.Western Blot检测结果说明SKBR3细胞HER2表达率高，MDA-MB-231细胞HER2表达率低。2.EGF对HER2高表达和低表达的乳腺癌细胞的生长均有促进作用，对HER2高表达的细胞作用明显。3.B2-S22-AFA可与表达HER2的乳腺癌细胞特异结合，且结合率随细胞HER2蛋白表达水平的增加而升高。B2-S22-AFA对HER2高表达的乳腺癌细胞有明显抑制作用，对HER2低表达的乳腺癌细胞无明显抑制作用。4.NBS法进行131Ⅰ标记小分子模拟肽方便快捷，稳定性较好，对多肽的免疫活性无明显损害。5.131Ⅰ标记B2-S22-AFA可与HER2高表达的乳腺癌细胞特异结合并能明显抑制其在体外的生长，为制备高表达HER2的乳腺癌及其它肿瘤的放射性靶向治疗药物提供依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第1章引 言

1.1乳腺癌与HER2的关系

1.2 HER2受体的结构和功能

1.3 HER2高亲和力模拟肽B2-S22-AFA的提出

1.4课题的提出及研究思路

第2章人乳腺癌细胞表面HER2受体表达水平的Western Blot分析

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

第3章HER2模拟肽B2-S22-AFA对乳腺癌细胞增殖的影响

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

第4章NBS法坩131I标HER2模拟肽B2-S22-AFA的实验研究

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

第5章培131I标HER2模拟肽B2-S22-AFA对乳腺癌细胞杀伤作用的研究

5.1材料与方法

5.2结果

5.3讨论

第6章结论与展望

致谢

参考文献

附录

综述 乳腺癌HER-2受体胞外结合区靶点治疗的研究进展

攻读学位期间的研究成果