3种石斑鱼微卫星标记的开发及跨种扩增

摘要

微卫星标记由于多态性高、共显性等特点被广泛应用于生物群体遗传结构分析、遗传连锁图谱构建等方面。石斑鱼是重要的世界性海水养殖鱼类，然而其遗传多样性的研究还十分有限。目前在石斑鱼中缺乏足够的微卫星标记。因此，为了评估石斑鱼的遗传多样性，进行分子辅助育种以指导生产，迫切需要开发大量的微卫星标记。通过FIASCO法构建七带石斑鱼(Epinephelusseptemfasciatus)、青石斑鱼(Epinephelus awoara)、美洲黑石斑鱼(Centropristisstriata)的基因组微卫星富集文库，分离微卫星DNA序列并对其特征进行分析。基因组DNA经Mse I限制性内切酶消化后，酶切片段与Mse I接头连接，用生物素标记的寡核苷酸探针与其杂交，杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上，变性洗脱获得单链目的片段，经PCR扩增形成双链，然后克隆到pMD18-T载体上，转化至DH5α中。菌落PCR法筛选阳性克隆，挑选不同大小的阳性克隆测序(ABI3730)。从七带石斑鱼、青石斑鱼、美洲黑石斑鱼的基因组微卫星富集文库中，分别得到66，56，39个微卫星序列。应用primer3软件对所筛选的微卫星序列进行引物设计，分别得到55，36，28对引物。通过6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行筛选，3种石斑鱼中分别得到12，12，11个多态性微卫星标记，并对各个位点等位基因数目、等位基因片段大小范围、观察杂合度、期望杂合度指标进行初步分析。结果表明：FIASCO法能有效提高微卫星标记筛选效率。将研究所得到的多态性微卫星标记在这3种石斑鱼中互相跨种扩增。大部分座位能得到较好的扩增结果。因此，可将本研究开发的微卫星标记尝试性地用于其他石斑鱼的遗传多样性等研究，为石斑鱼基因组结构分析、标记辅助育种以及数量性状基因的定位等研究提供候选微卫星标记。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章引言

1.1常用的分子标记

1.1.1限制性片段长度多态性(Restriction Fragemt Length Polymrphisn.PFLP)

1.1.2随机扩增多态性DNA(Random Aep Iified Polymorphic DNA,PAPD)

1.1.3扩增片段长度多态性(Amplified lified Fragment Length Polymorphism,AFLP)

1.1.4微卫星DNA(Microseatellite,SSR)

1.1.5单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism.SSCP)

1.1.6单核苷酸多态性(Single-Mucletide Polymorphism,SNP)

1.2微卫星标记简介

1.2.1微卫星标记的发展简史

1.2.2微卫星标记方法的优缺点

1.2.3微卫星突变

1.3微卫星标记开发策略

1.3.1经典方法

1.3.2构建微卫星富集文库筛选

1.3.3省略筛库法

1.3.4数据库搜索与同源序列引物借鉴法

1.4微卫星标记在鱼类遗传育种中的应用

1.4.1遗传多样性评估

1.4.2群体遗传结构分析

1.4.3遗传图谱构建

1.4.4品种鉴定和分类

1.5研究目的及意义

第2章材料和方法

2.1实验材料

2.2主要试剂及仪器

2.3实验方法

2.3.1基因组DNA抽提

2.3.2微卫星富集文库的构建

2.3.3含微卫星DNA序列的阳性克隆的筛选

2.3.4重复序列筛选及引物设计

2.3.5 PCR扩增筛选多态微卫星位点

2.3.6 PAGE电泳

2.3.7银染

2.3.8数据统计及分析

第3章实验结果

3.1基因组提取结果

3.2基因组酶切结果

3.3微卫星片段的富集

3.4菌落PCR检测重组率

3.5测序结果

3.6引物设计结果

3.7多态性微卫星引物筛选结果

3.8数据统计

3.9跨种扩增结果

第4章讨论

4.1磁珠富集法

4.2探针的选取

4.3微卫星位点的多态性

4.4微卫星DNA跨种扩增

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果