植物活性多糖对小鼠树突状细胞和巨噬细胞功能的调节作用

摘要

自然界中植物种类多种多样，具有免疫调节作用的药用植物也是数量繁多，如果能将其中起主要作用的有效成分分离出来，研究其理化性质及作用机理，对于植物功能性因子的研究及相应功能食品的开发将具有非常重要的意义。 抗原提呈细胞( antigen-presenting cell，APCs)主要承担对抗原物质的摄取，加工，并将抗原肽呈递给特异性T淋巴细胞，是启动免疫应答的关键因素。树突状细胞( dendritic cells，DCs)，是目前已知功能最强的专职APCs，具有诱导初次免疫应答的独特功能，能有效刺激初始型T细胞(naive T cells)增殖，在机体细胞免疫和体液免疫调控中具有独特的地位；巨噬细胞作为宿主天然免疫防御阵线的重要成员在先天性免疫防御和获得性免疫应答中同样起着不可忽视的作用。 为探讨中药植物的免疫增强药理机制，本研究初步建立了以小鼠骨髓来源DCs为靶细胞的植物化学物免疫活性筛选模型，在细胞水平初步探讨了大粒车前子精制多糖(crude polysaccharide from the seeds ofPlantago asiaticaL.，PL-PS)、大粒车前子多糖纯品(polysaccharide from the seeds of Plantago asiatica L.，PLP)、毛蕊花苷( acteoside)、异毛蕊花苷(isoacteoside)、茶叶糖蛋白(tea glycoprotein，TGP)、青钱柳多糖(polysaccharides from Cyclocarya paliurus(Batal.) Iljinskaja，CPC)的免疫调节功能。在此基础上，进一步研究了大粒车前子多糖PL-PS及PLP对小鼠骨髓来源DCs的分化、发育、成熟、迁移等方面的影响，并初步探讨了PL-PS对同为APCs的巨噬细胞功能的影响，为车前子产品开发提供理论依据。现将本文主要研究结果归纳如下： 1.探讨了PLP、CPC、PL-PS、TGP、毛蕊花苷和异毛蕊花苷对DCs前体细胞的细胞毒性。采用倒置显微镜观察细胞形态；用MTT法检测对细胞生长的增殖率；流式细胞仪测定细胞的早期凋亡。结果发现经各植物化学物处理后DCs前体细胞生长良好、细胞生存率高，对DCs前体细胞凋亡无明显影响，青钱柳多糖、毛蕊花苷和异毛蕊花苷对小鼠DCs前体细胞具有显著地促进增殖作用，提示青钱柳多糖、毛蕊花苷和异毛蕊花苷对小鼠DCs前体细胞的影响有可能通过直接诱导扩增及增强其细胞生物活性而发挥。实验结果发现本研究所采用的各植物化学物均无细胞毒性，可用于后续实验，并为临床应用及食用安全提供理论依据。 2.建立了DCs为靶细胞的植物化学物活性筛选模型。参照经典文献，结合国际上研究现状，采用手法分离纯化小鼠骨髓细胞，联合rmGM-CSF和rmIL-4诱导分化培养5天后，用MACS免疫磁珠法对细胞进行进一步纯化。通过采用各种形态学方法观察细胞形态，流式细胞仪分析细胞表面分子表达对细胞进行鉴定，结果发现该方法可以获得大量稳定的高纯度DCs，可用于后续植物化学物的免疫活性筛选。 3.应用已建立的以DCs为靶细胞的活性筛选模型，初步探讨了PLP、CPC、PL-PS、TGP、毛蕊花苷和异毛蕊花苷的免疫调节活性。采用倒置显微镜观察，发现DCs经PLP、CPC、PL-PS、TGP诱导后，细胞周围突起增多，细胞体积增大，形态更加典型。经毛蕊花苷和异毛蕊花苷刺激24 h后，与阴性对照组相比，细胞成团数量有所增加。MTT法检测各植物化学物对DCs增殖的影响，发现大部分植物化学物在相应的浓度范围内，对DCs的生长无显著影响；毛蕊花苷和异毛蕊花苷可促进DCs的增殖。流式细胞仪检测各植物化学物对DCs表型和吞噬功能的影响，发现与目前公认具有免疫促进功效并已应用于肿瘤辅助治疗的香菇多糖相似，PLP、PL-PS、毛蕊花苷和异毛蕊花苷在浓度为50μg/mL，TGP和CPC在浓度为100μg/mL时均可增强CD11c阳性细胞表达MHC II分子。并且发现经各植物活性提取物诱导后DCs吞噬荧光标记的葡聚糖的能力下降。研究结果初步发现PLP、CPC、PL-PS、TGP、毛蕊花苷和异毛蕊花苷均具有促进DCs表型及功能成熟的作用，从而为后续进一步实验提供理论依据。 4.探讨了不同剂量大粒车前子多糖PL-PS及PLP对DCs表型及吞噬功能的影响。采用流式细胞分析技术分析不同剂量PL-PS和PLP对DCs表面MHCII、CD80、CD86及CD40表达水平的影响。结果发现PL-PS和PLP均可促进MHC II、CD80、CD86和CD40的表达，在10～200μg/mL浓度范围内，呈剂量依赖关系。且PL-PS、PLP同剂量组相比，在对CD86分子表达上，PL-PS高、中剂量组比同剂量组的PLP强(p<0.05)，在对CD80的影响的表达上，PL-PS低剂量组比同剂量组的PLP强(p<0.05)。空白组DCs吞噬FITC标记的葡聚糖功能很强，而经不同剂量PL-PS，PLP处理后DCs的吞噬活性均明显下降。再次提示大粒车前子多糖可促进小鼠骨髓来源DCs表型及功能的成熟，并且这一促进功能在10～200μg/mL浓度范围内，呈剂量依赖关系。 5.探讨了不同剂量大粒车前子多糖PL-PS及PLP对DCs分泌功能的影响。采用Griess法检测各组DCs分泌NO的量；双抗体夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养液上清中细胞因子IL-12p70、IL-10、IL-1β及趋化因子RANTES的含量。结果发现，PL-PS及PLP能够诱导未成熟DCs分泌Th1型细胞因子IL-12p70和IL-1β，对Th2型细胞因子11.10则具有显著抑制作用(p<0.05)，并且这种刺激作用具有剂量依赖性，与同剂量的PLP相比，25pg/mL PL-PS可显著降低IL-10的产生(p<0.05)。PL-PS及PLP能够刺激未成熟DCs分泌RANTES-Thl型趋化因子，而且这种促进作用在PL-PS浓度为25μg/mL时最显著(p<0.05)。由此可见，PL-PS及PLP可以通过调节DCs分泌不同类型的细胞因子及趋化因子，诱导机体偏向Th1型细胞免疫应答，以及促进机体天然免疫向获得性免疫过渡。 6.探讨了不同剂量大粒车前子多糖PL-PS及PLP对DCs刺激T细胞功能的影响。采用MTT法检测PL-PS及PLP对DCs刺激OVA未致敏或致敏淋巴细胞增殖的影响，发现PL-PS和PLP均可增强树突状细胞的刺激未致敏和致敏淋巴细胞增殖的能力，说明经PL-PS或PLP刺激后，树突状细胞诱导免疫应答及抗原提呈功能，均增强。提示在适宜的T:DCs比时，PL-PS与PLP的作用一致，均能促进DCs对T细胞增殖的刺激作用。 7.探讨了不同剂量大粒车前子多糖PL-PS及PLP对DCs趋化功能的影响。采用半定量PCR法检测了DCs表面趋化因子受体CCR7 mRNA的表达水平。结果发现PL-PS或PLP均可影响DCs表面趋化因子受体CCR7的表达。其中，与阴性对照相比，PL-PS在浓度为100μg/mL，PLP在浓度为50μg/mL和100μg/mL时，可显著提高DCs表面CCR7的表达(p<0.01)。可以推测PLP或PL-PS对DCs的促成熟作用可能与趋化因子受体的表达有关。 8.初步探讨了大粒车前子多糖对DCs抗小鼠SP2/0骨髓瘤功能的影响。选取小鼠骨髓瘤细胞制备冻融抗原，使小鼠骨髓来源DCs负载SP2/0细胞冻融抗原，致敏T淋巴细胞，产生CTL，诱导出的T淋巴细胞对SP2/0细胞有明显CTL活性，而PL-PS及PLP的干预可促进这一功能的提高。所以大粒车前子多糖抗肿瘤机制与促进DCs抗原呈递能力有密切的关系，可提高机体对肿瘤细胞的特异性主动免疫功能。 9.探讨了大粒车前子多糖对小鼠巨噬细胞功能的影响。采用倒置显微镜、MTT法、Griess法、流式细胞术及ELISA法探讨了大粒车前子多糖对RAW264.7细胞株及小鼠腹腔巨噬细胞的影响。结果发现：PL-PS能刺激RAW264.7细胞株和小鼠腹腔巨噬细胞生成NO；促进RAW264.7细胞表面CD80、CD86、CD40的表达及TNF-α、IL-1β的分泌，并能促进腹腔巨噬细胞IL-10的分泌。提示大粒车前子多糖的免疫调节活性也与其对巨噬细胞的作用相关。。 上述结果提示：植物化学物的免疫调节可通过建立的以小鼠骨髓来源DCs为靶细胞的模型来进行初步的筛选和探讨。大粒车前子多糖PL-PS及PLP可通过促进DCs表面MHC II类分子，共刺激分子的表达及Th1型细胞因子的分泌，刺激T淋巴细胞的增殖，诱导Th1型免疫应答并增强CTL对肿瘤细胞的特异性杀伤活力。并通过促进DCs表面趋化因子受体CCR7 mRNA的表达，促进DCs的移行和发育成熟。说明PL-PS及PLP均作用于DCs，通过对DCs移行、成熟、功能的上调作用而促进免疫应答的启动，增强机体的免疫功能。另外，PL-PS也可通过对巨噬细胞的作用来调节机体免疫应答。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语注释

声明

第1章 绪论

1.1引言

1.2 DCs的生物学特性及其在药理活性中的研究

1.2.1 DCs的来源和分布

1.2.2 DCs的供体来源及培养方法

1.2.3 DCs的分化成熟过程

1.2.4 DCs的生物学功能

1.2.5中药多糖对DCs的调控作用

1.3巨噬细胞的生物学特性及其在药理活性中的研究

1.3.1巨噬细胞的生物学特性

1.3.2中药多糖对巨噬细胞的免疫调节作用

1.4车前子的国内外研究概况

1.4.1车前子的资源分布

1.4.2车前子主要化学成分

1.4.3车前子多糖药理学研究进展

1.5本研究的目的意义、主要研究内容和创新性

1.5.1目的意义

1.5.2主要研究内容

1.5.3本研究的创新性

第2章 植物化学物对DCs前体细胞增殖及毒性研究

2.1引言

2.2实验材料与仪器

2.2.1实验材料

2.2.2有关溶液配制

2.2.3实验仪器

2.3实验方法

2.3.1植物化学物的配制

2.3.2 DCs前体细胞的分离

2.3.3细胞形态学评价

2.3.4 MTT法检测DCs前体细胞的生长

2.3.5流式细胞仪检测细胞早期凋亡

2.3.6数据处理

2.4结果与分析

2.4.1植物化学物对DCs前体细胞形态的影响

2.4.2植物化学物对DCs前体细胞生长的影响

2.4.3细胞早期凋亡检测结果

2.5讨论

2.6本章小结

第3章 DCs的体外扩增培养、纯化及鉴定

3.1引言

3.2实验材料与仪器

3.2.1实验材料

3.2.2有关溶液配制

3.2.3实验仪器

3.3实验方法

3.3.1小鼠骨髓来源DCs的体外诱导及培养

3.3.2台盼蓝拒染实验检测细胞存活率

3.3.3小鼠骨髓来源DCs的纯化

3.3.4形态学鉴定

3.3.5流式细胞检测细胞表型

3.3.6数据处理

3.4结果与分析

3.4.1细胞形态学观察

3.4.2细胞表面分子表达水平检测

3.5讨论

3.6本章小结

第4章 植物化学物对DCs表型及功能影响的初步探讨

4.1引言

4.2实验材料与仪器

4.2.1实验材料

4.2.2有关溶液配制

4.2.3实验仪器

4.3实验方法

4.3.1鲎试剂检测样品细菌内毒素含量

4.3.2形态学观察

4.3.3 MTT法检测样品对DCs增殖的影响

4.3.4免疫染色和流式细胞分析

4.3.5吞噬实验

4.3.6数据处理

4.4结果与分析

4.4.1各植物化学物的内毒素含量

4.4.2各植物化学物对DCs形态的影响

4.4.3各植物化学物对DCs增殖的影响

4.4.4各植物化学物对DCs表达MHCⅡ分子的影响

4.4.5各植物化学物对DCs吞噬功能的影响

4.5讨论

4.6本章小结

第5章 大粒车前子多糖对DCs表型及吞噬功能的影响

5.1引言

5.2实验材料与仪器

5.3实验方法

5.3.1样品内毒素的去除验证实验

5.3.2实验分组

5.3.3细胞形态鉴定

5.3.4免疫染色和流式细胞分析

5.3.5吞噬实验

5.3.6数据处理

5.4结果与分析

5.4.1样品内毒素的去除验证实验

5.4.2 PL-PS，PLP对DCs形态的影响

5.4.3 PL-PS，PLP对DCs表面分子表达的影响

5.4.4 PL-PS，PLP对DCs吞噬功能的影响

5.5讨论

5.6本章小结

第6章 大粒车前子多糖对DCs分泌功能的调控

6.1引言

6.2实验材料与仪器

6.2.1实验试剂

6.2.2实验仪器

6.3实验方法

6.3.1 Griess法检测NO

6.3.2 ELISA法检测细胞因子L-12p70、IL-10及IL-1β

6.3.3 ELISA法检测趋化因子RANTES

6.3.4数据处理

6.4结果与分析

6.4.1 PLP对DCs分泌炎症因子NO的影响

6.4.2 PL-PS，PLP对DCs分泌细胞因子的影响

6.4.3 PL-PS，PLP对DCs分泌趋化因子RANTES的影响

6.5讨论

6.6本章小结

第7章 大粒车前子多糖对DCs刺激T细胞增殖的影响

7.1引言

7.2实验材料与仪器

7.2.1实验材料

7.2.2实验仪器

7.3实验方法

7.3.1混合淋巴细胞反应(MLR)

7.3.2抗原提呈能力检测

7.3.3数据处理

7.4结果与分析

7.4.1 PL-PS，PLP对DCs诱导同种异体淋巴细胞增殖能力的影响

7.4.2 PL-PS，PLP对DCs诱导同基因T淋巴细胞增殖能力的影响

7.5讨论

7.6本章小结

第8章 大粒车前子多糖对DCs趋化作用的影响

8.1引言

8.2实验材料与仪器

8.2.1实验试剂

8.2.2相关试剂配制

8.2.3实验仪器

8.3实验方法

8.3.1总RNA的提取

8.3.2总RNA的质量、浓度检测

8.3.3 RNA的逆转录体系

8.3.4聚合酶链式反应(PCR)

8.3.5琼脂糖电泳

8.3.6数据处理

8.4结果与分析

8.4.1总RNA的质量、浓度检测

8.4.2 PCR产物的电泳结果

8.5讨论

8.6本章小结

第9章 大粒车前子多糖对DCs抗SP2/0功能的影响

9.1引言

9.2实验材料与仪器

9.2.1实验材料

9.2.2相关试剂配制

9.2.3实验仪器

9.3实验方法

9.3.1小鼠SP2/0骨髓瘤细胞的培养

9.3.2小鼠SP2/0骨髓瘤抗原肽的制备

9.3.3小鼠SP2/0骨髓瘤可溶性抗原负载DCs的诱导培养

9.3.4 CTL的诱导及对SP2/0骨髓瘤细胞的特异性杀伤(LDH释放法)

9.3.5数据处理

9.4结果与分析

9.5讨论

9.6小结

第10章 大粒车前子多糖活化巨噬细胞功能的研究

10.1引言

10.2实验材料与仪器

10.2.1实验材料

10.2.2有关溶液配制

10.2.3实验仪器

10.3实验方法

10.3.1 RAW264.7细胞传代培养

10.3.2小鼠腹腔巨噬细胞的原代培养

10.3.3细胞形态学观察

10.3.4大粒车前子多糖对RAW264.7和腹腔巨噬细胞生长的影响

10.3.5大粒车前子多糖对RAW264.7和腹腔巨噬细胞生成NO的影响

10.3.6大粒车前子多糖对RAW264.7细胞表面分子表达的影响

10.3.7大粒车前子多糖对RAW264.7和腹腔巨噬细胞分泌细胞因子的影响

10.3.8数据处理

10.4结果与分析

10.4.1大粒车前子多糖对RAW264.7和腹腔巨噬细胞细胞形态学观察

10.4.2大粒车前子多糖对RAW264.7和腹腔巨噬细胞生长的影响

10.4.3大粒车前子多糖对RAW264.7和腹腔巨噬细胞生成NO的影响

10.4.4大粒车前子多糖对RAW264.7细胞表面共刺激分子的影响

10.4.5大粒车前子多糖对RAW264.7和腹腔巨噬细胞分泌细胞因子的影响

10.5讨论

10.6本章小结

第11章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间研究成果