重组德国小蠊变应原Blag2对过敏性哮喘的作用与机理

摘要

目的： 通过对哮喘模型小鼠腹腔注射重组德国小蠊变应原制剂Blag2（rBlag2）进行免疫治疗，探讨重组蛋白rBlag2制剂在过敏性哮喘抗原特异性免疫治疗中的疗效及机制。 方法： 1、重组蛋白rBlag2变应原制剂的克隆、表达。 2、18只雌性BALB/c小鼠随机分为3组，即正常对照组（A组）、哮喘模型组（B组）和重组蛋白rBlag2治疗组（C组）。B、C两组用Al（OH）3佐剂乳化的重组蛋白rBlag2腹腔注射免疫，剂量为每次50μg/（只·次），共3次，每次间隔1周。A组以生理盐水50μl代替变应原。末次致敏后2周，进行免疫治疗，C组小鼠腹腔注射rBlag2，100μl（只·次），每2天1次，连续8次。A、B2组以磷酸盐缓冲液（PBS）100μl代替变应原。末次治疗后1周，进行滴鼻激发，将所有小鼠麻醉后，B、C2组以rBlag2滴鼻，50μg/（只·次），每天1次，连续7天。A组以PBS代替变应原滴鼻。从第51天（激发第一天）开始，每天下午4点在动物中心观察各组实验小鼠的症状和体征，到第57天结束。所有小鼠最后一次滴鼻24h后进行下列各项检测。 3、使用全身性体积描记法观察最后1次滴鼻24h后各组小鼠雾化吸入PBS缓冲液和1、3、10、30、100mg/ml乙酰甲胆碱后扩大间隙（Penh）值的变化，绘制呼吸曲线，观察气道Penh值的变化。 4、各组小鼠气管插管进行支气管肺泡灌洗，显微镜下观察支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数和细胞分类。 5、各组小鼠用ELISA试剂盒检测血清中IgE和IgG2a抗体。 6、各组小鼠取肺组织，常规HE染色观察小鼠肺的炎症变化。 7、各组小鼠的肺组织通过免疫组化观察Bcl-2阳性嗜酸性粒细胞（EOS）的细胞数量变化。 8、各组小鼠取脾组织，检测脾组织的TLR-2，4和PAR-2，4受体表达情况。 结果： 1.与正常对照组相比，哮喘模型组小鼠激发后可见喘息、呼吸加深加快、烦躁不安等症状；气道Penh值增加（P<0.05）；BALF中的细胞总数明显增加，分类细胞以嗜中性和嗜酸性粒细胞为主，嗜酸性粒细胞数超过90％；血清特异性抗体IgE、IgG2a明显增加（P<0.01）；肺组织可见炎症细胞聚集，组织水肿和上皮损伤；Bcl-2阳性EOS细胞数量明显增加；脾组织PAR-2，PAR-4和TLR-4的表达明显降低，TLR-2的表达无明显变化，证明建模成功。 2.与哮喘模型组相比，重组蛋白rBlag2治疗组小鼠喘息、呼吸加深加快、烦躁不安等症状明显减轻。 3.与哮喘模型组相比，重组蛋白rBlag2治疗组的Penh值下降，差异有统计学意义（P<0.05）。 4.哮喘模型组BALF的细胞总数和EOS数分别为（24.60±15.08）×105/ml和（22.20±3.76）×105/ml，而重组蛋白rBlag2治疗组细胞总数[（14.30±4.95）×105/ml]和EOS数[（5.20±1.56）×105/ml]显著减少（P<0.01）。 5.与哮喘模型组相比，重组蛋白rBlag2治疗组小鼠皿清中rBlag2特异性IgE明显减少，而IgG2a抗体有明显增加，有显著差异（P<0.01）。 6.哮喘模型组小鼠肺组织支气管周围炎症细胞聚集，肺组织上皮损伤，组织水肿，重组蛋白rBlag2治疗组上述变化明显减轻。 7.与哮喘模型组相比，重组蛋白rBlag2治疗组肺组织Bcl-2阳性EOS细胞数量明显减少且蛋白阳性表达较弱。 8.哮喘模型组小鼠脾组织PAR-2，PAR-4和TLR-4的表达较正常对照组明显降低，经重组蛋白rBlag2治疗后，其表达水平上升，TLR-2的表达无明显变化。 9.重组蛋白rBlag2治疗组小鼠的哮喘症状和体征，气道Penh值，BALF中细胞总数和细胞分类，血清IgE和IgG2a抗体水平，肺组织的炎症情况，Bcl-2阳性嗜酸性粒细胞的表达情况以及脾组织的TLR-2，4和PAR-2，4受体表达情况均接近于正常对照组。 结论： 重组蛋白rBlag2制剂通过有效抑制变应原诱导的气道高反应性、过敏性气道炎症和血清IgE抗体的产生，以及促进嗜酸性粒细胞的凋亡而改善了肺组织的炎症症状，从而对过敏性哮喘有治疗作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第1章前言

第2章材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3统计学分析

第3章结果

3.1重组变应原制剂的表达，纯化及免疫活性检测

3.2各组小鼠症状和体征的改变

3.3小鼠气道高反应性测定

3.4肺泡灌洗液细胞计数和染色观察

3.5重组蛋白rBla g 2治疗对血清特异性抗体的影响

3.6重组蛋白rBla g 2对致敏小鼠肺部炎症的治疗作用

3.7重组蛋白rBla g 2对小鼠肺组织EOS凋亡的影响

3.8脾组织PAR-2，4和TLR-2，4的受体表达

第4章讨论

第5章结论

致谢

参考文献

附录文献综述哮喘患者神经-内分泌-免疫的相互调节

攻读学位期间的研究成果