急性肝损伤血清诱导骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞的实验研究

摘要

目的:
　　 探讨急性肝损伤血清诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchyme stemcells,BMSCs)体外分化为类肝细胞的能力,为利用:BMSCs治疗终末期肝脏疾病患者提供实验依据。
　　 方法:
　　 利用全骨髓培养法分离提取大鼠BMSCs,在倒置显微镜下观察所提取的原代细胞的形态学变化,免疫荧光染色法检测BMSCs表面特异性标志物CD29及造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)表面特异性标志物CD34的表达。建立急性肝损伤模型:模型组将四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCL4)-大豆油溶液腹腔注射入大鼠后对其进行部分肝叶切除术；假手术组腹腔注射等剂量的生理盐水后开腹后即关腹,造模后用全自动生化分析仪检测大鼠血清谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase,ALT)、谷草转氨酶(Glutamic oxaloacetictransaminase,AST)及总胆红素值(total bilirubin,TBIL),取大鼠肝脏进行HE染色,倒置显微镜下观察两组大鼠肝脏病理学改变。将造模组、假手术组大鼠血清及胎牛血清分别用于培养BMSCs,分为实验组、对照组及空白对照组,实验组:造模组大鼠血清配制成的培养基培养BMSCs,对照组:假手术组大鼠血清配制成的培养基培养BMSCs,空白对照组:常规细胞培养中使用的胎牛血清配制成的培养基培养BMSCs。观察实验组、对照组及空白对照组培养后BMSCs细胞形态学变化；用RT-PCR法分别于诱导7d、14d、21d检测细胞表面肝细胞特异性标志物AFP、ALB、CK-18的表达。
　　 结果:
　　 (1)倒置显微镜下观察发现原代的BMSCs,贴壁生长,呈梭形,漩涡状排列；免疫荧光染色法鉴定BMSCs,荧光显微镜下观察90％细胞表达CD29,不表达CD34。
　　 (2)模型组大鼠血清ALT、AST及TBIL较假手术组均升高,两组大鼠血清ALT及AST比较,差异有显著统计学意义(P<0.001),TBIL比较差异有统计学意义(P<0.05)。两组大鼠肝脏组织学镜下病理评分,假手术组大鼠肝脏细胞形态正常,模型组肝脏细胞胞浆出现空泡,核固缩等坏死征象,模型组病理评分明显高于假手术组,两组间比较差异有显著统计学意义(P<0.001)。
　　 (3)倒置显微镜下观察实验组BMSCs随时间的延长,逐渐成为三角形,对照组及空白对照组BMSCs形态仍为梭形,RT-PCR检测实验组、对照组及空白对照组细胞表面AFP、ALB、CK-18的表达:
　　 AFPmRNA:肝损伤血清诱导7d细胞表面有AFPmRNA的表达；14d细胞表面AFPmRNA的较诱导表达较7d下调,两组间比较,差异有显著统计学(P<0.001),21d时,细胞表面AFPmRNA无表达。对照组及空白对照组细胞在各时间点均无AFPmRNA表达。
　　 ALBmRNA:肝损伤血清诱导7d、14d、21d细胞表面细胞表面均有ALBmRNA的表达,14d与7d比较,ALBmRNA的表达上调,差异有统计学意义(P<0.05),21d与14d比较,ALBmRNA的表达上调,差异有显著统计学意义(P-<0.001)。对照组及空白对照组细胞在各时间点均无ALBmRNA表达。
　　 CK-18mRNA:肝损伤血清诱导7d、14d、21d细胞表面均有CK-18mRNA的表达。14d与7d比较,CK-18mRNA的表达上调,差异显著有统计学意义(P<0.001)；21d与14d比较,CK-18mRNA的表达上调,差异有显著统计学意义(P<0.001)。对照组及空白对照组细胞在各时间点均有CK-18mRNA表达,与实验组7d相比,差异无统计学意义(P>0.05),与实验组14d比较,差异有统计学意义(P<0.05),与实验组21d相比,差异显著有统计学意义(P<0.001)。
　　 结论:
　　 (1)25％(体积比)CCL4-大豆油溶液腹腔注射加10％(切除肝叶重量/肝总重量)肝切除可致急性肝损伤,且易成模,模型存活率高。
　　 (2)CCL4-大豆油溶液腹腔注射结合部分肝叶切除所致的急性肝损伤大鼠血清能够诱导BMSCs分化为类肝细胞,为今后治疗因肝脏病变而致肝切除的患者利用自体血清诱导自体BMSCs分化为类肝细胞提供理论基础。