心脉隆对缺氧缺血性脑损伤模型新生大鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制的研究

摘要

目的:
　　 1、观察缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型新生大鼠心肌损伤及细胞凋亡情况。
　　 2、研究心脉隆(xinmailong,XML)对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型新生大鼠心肌损伤及细胞凋亡的影响,及其与磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路活化的关系。
　　 方法:
　　 1、新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型制作及分组:128只新生7d龄SD大鼠随机分为4组(每组32只):1.假手术对照组(Sham组)；2.缺氧缺血性脑损伤模型对照组(HIBD组)；3.HIBD+心脉隆组(XML组):4.HIBD+XML+特异性PI3K阻滞剂LY294002组(LY组)。结扎实验鼠左颈总动脉后吸入8％浓度氧2.5h制成HIBD模型。Sham组仅游离出左颈总动脉,不结扎,缝合皮肤,不缺氧；HIBD组缺氧缺血(HI)后不给于任何药物进行干预:XML组于HIBD模型建立后迅速取出大鼠,复氧30min后给与5mg/kgXML注射液腹腔注射(i.p)；LY组则先后给与LY294002(0.3mg/kg ip)及XML注射液(5mg/kg ip),两种药物给药间隔时间为1.5min。各组均于HI后24h、48h、72h、7d四个时间点(每个时间点各8只)分批取血及心肌组织进行各项指标的检测。
　　 2、观察各组实验大鼠实验过程中一般表现及存活情况,并计算其存活率及7d体重增长值:测定血清心肌酶CK、LDH水平；HE染色后光镜下观察心肌组织病理形态学改变；Hoechst33258荧光染色及TUNEL法分别定性和定量检测心肌细胞凋亡；S-P免疫组织化学法测定PI3K、p-Akt信号蛋白表达。
　　 结果:
　　 1、一般表现:Sham组实验过程中无明显变化,其余3组实验鼠置于缺氧环境5-10分钟后开始躁动不安,15-20分钟后活动减少,均趴伏于容器一角,并相继出现不同程度的缺氧症状；恢复通气后短时间内可出现头向结扎侧旋转爬行等行为学改变。
　　 2、存活率:Sham组存活率为100％(32/32)；HIBD组存活率为87.50％(28/32)；XML组存活率为93.75％(30/32),LY组存活率为81.25％(28/32)。各组间存活率比较无明显统计学差异(P>0.05)。
　　 3、7d体重增长值:HIBD组实验大鼠体重增长较缓慢,7d体重增长值(为14日龄体重-7日龄体重)显著落后于Sham组(P<0.01),XML组较HIBD组实验大鼠7d体重增长值显著增加(P<0.01),但仍明显落后于Sham组(P<0.01),LY组与其余3组比较实验大鼠7d体重增长值均显著滞后(P<0.01)。
　　 4、血清心肌酶CK、LDH水平:Sham组各时间点CK、LDH浓度无明显变化(P>0.05)；其余3组上述指标均于HI后24小时开始升高,72小时达到高峰,之后逐渐下降,持续至7d仍显著高于Sham组(P<0.01),各时间点之间比较差异有统计学意义(P<0.01):相同时间点:XML组CK、LDH水平显著低于HIBD组(P<0.01),LY组CK、LDH水平与HIBD组及XML组比较均显著升高(P<0.01)。
　　 5、心肌组织病理改变:HE染色、光学显微镜下观察可见Sham组大鼠心肌细胞排列规则,组织间无水肿,结构完整,胞浆中横纹清楚,细胞质均匀淡染,细胞核致密清晰可见；HIBD组及LY组均可见心肌细胞排列紊乱,细胞水肿明显,心肌间质出血,部分细胞出现坏死,核消失,细胞呈空泡样,心肌纤维成波浪状改变,但细胞凋亡不明显。(上述改变以LY组HI后72h最为显著)；相同时间点:XML组上述改变较HIBD组及LY组均明显减轻,心肌间质出血及细胞坏死不明显。
　　 6、心肌细胞凋亡形态学改变:Hochst33258染色,荧光显微镜下观察可见Sham组细胞核边界规则整齐,染色均匀并淡染呈正常的蓝色；其余3组均可见凋亡染色阳性细胞,数目多少不一,以LY组HI后72h最为多见,表现为细胞核致密浓染、皱缩、碎裂、颜色透亮有些发白；相同时间点:XML组凋亡阳性细胞数较HIBD组及LY组均明显减少。
　　 7、心肌细胞凋亡指数(AI)结果分析:Sham组各时间点均仅见散在凋亡细胞；其余3组AI均于HI后24h开始升高,72h达到高峰,持续至7d时仍高于Sham组(P<0.01),各时间点之间比较有明显差异(P<0.01)。相同时间点:XML组与HIBD组相比AI明显降低(P<0.01)；LY组AI水平与HIBD组及XML组比较均显著升高(P<0.01)。
　　 8、心肌组织PI3K、p-Akt信号蛋白表达:
　　 8.1、心肌组织P13K信号蛋白表达:各组均可见PI3K蛋白表达阳性信号。相同时间点:各组间比较均无显著性差异(P>0.05)；相同处理组:各时间点之间比较均无统计学差异(P>0.05)。
　　 8.2、心肌组织p-Akt信号蛋白表达:Sham组p-Akt蛋白呈弱阳性表达,组内各时间点之间无显著性差异(P>0.05)；而HIBD组、XML组p-Akt蛋白表达水平均明显增高,且均于HI后24h表达最为明显,之后逐渐下降,持续至7d仍高于Sham组(P<0.01),组内各时间点比较差异有统计学意义(P<0.01)。相同时间点:XML组与HIBD组比较p-Akt蛋白表达水平进一步显著升高(P<0.01)；LY组p-Akt蛋白表达水平与HIBD组、XML组相比均明显降低(P<0.01),与对照组相比,则差异无统计学意义(P>0.05)；LY组各时间点之间比较无显著性差异(P>0.05)。
　　 9、心肌组织PI3K、p-Akt与AI之间进行相关性分析:p-Akt表达与AI呈明显负相关性(r=-0.883,P<0.001),而。PI3K与AI之间无明显相关性(r=-0.150,P>0.05)。
　　 结论:
　　 1、新生大鼠HIBD后早期心肌细胞即可出现一定程度的损伤及凋亡,以HI后72h最为明显,持续至HI后7d仍可见异常损伤及凋亡细胞。
　　 2、PI3K/Akt信号途径可能参与了HIBD模型建立本身所启动的自我保护机制,从而发挥一定程度的内源性心肌保护及抗凋亡作用。
　　 3、药物心脉隆通过PI3K/Akt信号通路介导对HIBD模型新生大鼠心肌损伤及细胞凋亡的抑制作用。
　　 4、PI3K阻滞剂LY294002可取消心脉隆的上述心肌保护及抗凋亡作用,并可能在一定程度上阻断了HIBD模型建立本身所启动的内源性细胞生存信号途径的激活。
　　 5、LY294002上述作用的发挥主要体现在阻断Akt的磷酸化而并不显著降低PI3K的表达水平。