缺血再灌注肾损伤后MiRNA-210、MiRNA-320和MiRNA-92a的变化及其与血管新生关系的探讨

摘要

目的:
　　 肾缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤是在缺血基础上恢复血流,导致组织损伤反而加重的现象,常见于肾部分切除术后和肾移植等过程中,是导致急性肾功能损伤的主要原因之一。肾缺血后造成肾脏血管受阻血流量减少,导致肾脏微血管损伤,改变小管代谢甚至坏死,影响肾脏血流。因而尽快恢复缺血区的血供是修复肾缺血损伤的关键之一。动物实验和临床研究均表明肾脏缺血后可诱导反应性血管新生现象,且伴随有多种血管生长因子的表达。研究发现,VEGF信号通路对血管的发生发展,包括细胞增殖、迁移、分化及血管生成等多个方面有重要调控功能,也是介导肾缺血后血管新生的主要信号通路。近年来,研究报道一些特异的miRNA可调控组织血管新生,缺血后,组织中一系列的miRNA表达发生显著改变。研究提示miRNAs这一作用可能是通过调控其靶标基因参与血管生成的信号通路如VEGF信号通路,影响血管生成。
　　 本研究通过制作肾缺血/再灌注小鼠模型,观察缺血再灌注肾损伤后肾组织血管新生及miR-210、miR-92a和miR-320的表达变化并探讨其靶向VEGF信号通路的关系,以期为缺血性肾损伤提供新的思路。积极探讨缺血性肾损伤后血管新生的分子机制也对于修复缺血性肾损伤具有重要意义。
　　 方法:
　　 1、制作缺血性肾损伤模型,采用微型动脉夹夹闭小鼠双侧肾蒂制备急性肾缺血/再灌注损伤模型。于I/R后4h、24h、48h、72h分批处死各组小鼠,取肾组织标本待检。通过观察血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)及肾组织病理改变判断模型成功。
　　 2、采用实时荧光定量PCR方法,观察组织缺血诱导的microRNAs(miRNA210、miRNA-92a、miRNA-320)的表达变化。
　　 3、免疫组织化学染色检测CD31表达,判断缺血组织微血管内皮细胞增生状况;
　　 4、采用Western blot和Real-time PCR方法观察与VEGF信号通路相关分子血管内皮生长因子及其受体(VEGF、Flk-1)各分子蛋白和基因表达水平的变化。
　　 结果:
　　 1、肾缺血再灌注模型判断:肾脏I/R损伤后24h血清Scr和BUN水平升高明显,与假手术组(sham)比较有统计学意义(P＜0.05),HE染色结果显示肾缺血组织病理改变明显,判断肾缺血再灌注模型制作成功。
　　 2、缺血性肾损伤后miRNA210、miRNA-92a和miRNA-320的表达变化:肾脏I/R4h和24h后,miR-210的表达明显上调,其上调倍数分别为2.02±0.29,5.58±0.16;miR-92a的表达上调,其上调倍数分别为3.23±0.74,1.53±0.33;而I/R4h和24h后,miR-320其上调倍数分别为2.13±0.95,3.43±1.05。
　　 3、缺血性肾损伤后组织微血管密度变化:CD31免疫组化检测微血管密度结果显示,肾缺血后缺血组织中新生血管增生明显,与假手术组比较有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4、缺血性肾损伤后VEGF信号通路相关分子的表达变化:RT-PCR结果显示,肾I/R.损伤4h、24h后,缺血组织VEGF和Flk-1mRNA表达水平显著上调,其上调倍数分别为4.75±0.35,3.09±0.86和1.90±0.05,2.46±0.36(P＜0.05)。Western Blot结果显示,肾I/R损伤24h组、72h组Flk-1蛋白条带均较假手术组蛋白条带深,蛋白表达量较高(P＜0.05),提示I/R损伤后Flk-1蛋白的表达水平上升。
　　 结论:
　　 实验结果表明,肾缺血后组织反应性新生血管增生明显,miRNA210、miRNA-92a和miRNA-320的表达变化显著上调,且伴随着VEGF信号通路相关分子VEGF和Flk-1蛋白和基因表达水平上调。研究结果提示,肾缺血后miRNA210、miRNA-92a和miRNA-320可能通过靶向VEGF信号通路参与肾缺血后血管再生的调控过程。