NF-κBp65反义寡核苷酸对TNBS诱导BALB/C小鼠慢性结肠炎肠道纤维化的影响

摘要

背景：炎症性肠病包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，是一组病因及发病机制尚不十分清楚的胃肠道慢性炎症性疾病，以慢性炎症和反复发作为特征。而克罗恩病又以肠道透壁性炎症为特点，长期的慢性炎症导致肠道大量异常的细胞外基质沉积，从而引起肠壁纤维化狭窄，并最终导致肠梗阻。40％以上的克罗恩患者会有不同程度的肠梗阻，而其中大约有80％的患者最终需要内镜或外科手术治疗，效果却不尽人意。然而，目前炎症性肠病肠道发生纤维化的机制不明确且临床上仍缺乏有效的治疗药物。许多实验证实NF-κBp65反义寡核苷酸具有下调NF-κB表达作用，从而下调细胞因子表达，起到抑制炎症的作用，如果其可以有效减轻实验性慢性结肠炎动物模型肠道纤维化，无疑有望成为治疗炎症性肠病抗炎抗纤维化的生物制剂。
　　 目的：探讨预防性NF-κBp65反义寡核苷酸灌肠对TNBS/酒精诱导BALB/C小鼠慢性结肠炎肠道炎症及纤维化的影响。通过观察各组小鼠疾病活动指数，分析结肠组织学病理变化、胶原纤维增生程度、NF-κBp65、TNF-α的表达水平，研究NF-κBp65反义寡核苷酸预防性应用在抗慢性结肠炎肠道炎症及纤维化中的作用，进而探讨NF-κBp65反义寡核苷酸的作用机制，为炎症性肠病肠壁纤维化基因治疗提供理论依据。
　　 方法：将体重约20-24克BALB/C雌性小鼠随机分成四组，每组12只，分别为空白对照组、TNBS模型组(TNBS组)、NF-κBp65反义寡核苷酸预防治疗组(ASOND组)、NF-κBp65错义寡核苷酸阴性对照组(MSOND组)。空白对照组每周仅给予生理盐水100ul灌肠1次，连续6周。而TNBS组、ASOND组、MSOND组分别先给予生理盐水100ul、25nmolNF-κBp65反义寡核苷酸100ul、25nmolNF-κBp65错义寡核苷酸100ul灌肠，于次日给予2mgTNBS+50％酒精100ul灌肠，连续6周。所有组别于最后一次灌肠后1周处死小鼠，采集结肠组织，HE染色评估小鼠结肠组织炎症程度、VG染色评估小鼠肠道纤维化程度、免疫组织化学检测小鼠结肠组织NF-κBp65蛋白及TNF-α蛋白的表达水平。
　　 结果：⑴每次TNBS灌肠24小时内小鼠即出现少动、少食等症状，持续2-3天后有所减轻，前3周最为重，且每组均有小鼠死亡，第4周起症状相对稳定，且死亡小鼠明显减少；体重在灌肠后2-4天下降，随后稳定甚至增加。空白对照组不出现上述症状，体重呈进行性增加。与空白对照组比较，TNBS组、MSOND组、ASOND组小鼠疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分均增高(P<0.05)，而ASOND组DAI评分低于TNBS组和MSOND组(P<0.05)。⑵肉眼观察各组小鼠结肠标本，空白对照组可见正常结肠组织，无充血、水肿，触之柔软性好，而TNBS组、MSOND组可见充血、水肿的结肠组织，病变结肠僵硬、变形、肠腔变窄，个别可见肠管粘连、肠管变短，PP淋巴结增大。而ASOND组小鼠结肠组织无明显充血、水肿，肠管无明显的变形、变短，触之柔软性尚可。除空白对照组外，三组小鼠肠道均可见不同程度的炎症表现，如结肠组织固有层炎症细胞浸润，隐窝破坏、杯状细胞减少等。TNBS组和MSOND组炎症评分明显高于ASOND组和空白对照组(P<0.05)，而ASOND组与空白对照比较，无统计学意义(P>0.05)。⑶TNBS组和MSOND组结肠组织镜下可见固有肌层明显增厚，大量胶原纤维沉淀于粘膜下，而ASOND组纤维增生较轻。与空白对照组和ASOND组比较，TNBS组和MSOND组纤维化明显(P<0.05)，ASOND组较空白对照组增生明显(P<0.05)。⑷各组小鼠结肠组织中均可发现NF-κB p65蛋白表达，但空白对照组和ASOND组明显低于TNBS组和MSOND组(P<0.05)，而前两组间比较无统计学意义(P>0.05)。此外，前两组阳性细胞主要存在于上皮细胞，且以胞浆着色为主，而后两组阳性细胞主要在固有层，且以胞核着色为主。⑸与空白对照组和ASOND组比较，TNBS组和MSOND组小鼠结肠组织中的TNF-α蛋白表达均增高(P<0.05)，而空白对照组与ASOND组比较，无统计学意义(P>0.05)。
　　 结论：①通过对TNBS组小鼠的疾病活动指数的观察、结肠病理及结肠纤维化增生程度的分析，证实2mgTNBS+50％酒精诱导慢性结肠炎及肠壁纤维化动物模型建立成功。②NF-κBp65反义寡核苷酸可下调NF-κBp65蛋白和TNF-α蛋白表达，NF-κBp65错义寡核苷酸无以上作用。③NF-κBp65反义寡核苷酸可减轻小鼠肠道炎症和肠壁纤维化，而NF-κBp65错义寡核苷酸无此生物学效应。④NF-κBp65反义寡核苷酸有望成为炎症性肠病慢性肠道炎症及肠纤维化基因治疗药物。