钾和Kv1.3通道对巨噬细胞功能的影响

摘要

持续性不卧床腹膜透析(Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis，CAPD)是终末期肾脏病(end stage renal disease，ESRD)的替代治疗方法之一。然而，腹膜透析相关性腹膜炎是腹膜透析主要并发症，是技术失败的主要原因。研究显示低钟在腹膜透析患者中发生率在10％-36％不等，老年患者中的发生率可高达55.6％。近年研究提示低钟是腹膜透析相关性腹膜炎发生的危险因子之一。电压门控性钾通道1.3(voltage-gated potassitim channel1.3，Kv1.3)是钾离子进出细胞的主要途径之一。Kv1.3在自身免疫性疾病淋巴细胞表达异常，选择性阻滞钾通道，可以有效减轻或延缓疾病的发生发展。那么，作为腹腔局部防御中的主要细胞群--腹腔巨噬细胞，其Kv1.3在腹膜透析相关性腹膜炎中表达是否发生变化?低钾血症是否影响腹腔巨噬细胞表面Kv1.3的表达?低钾是否影响巨噬细胞功能?目前相关研究报道甚少。本研究拟从体内外水平探讨低钟和腹腔巨噬细胞Kv1.3表达在腹膜透析相关性腹膜炎发生中的可能作用。
　　 第一部分腹膜透析相关腹膜炎患者血钾及腹腔巨噬细胞Kv1.3表达变化研究
　　 一、目的
　　 探讨腹膜透析相关性腹膜炎患者血钾及腹腔巨噬细胞Kv1.3的表达变化及其临床意义
　　 二、方法
　　 本研究为横断面研究，收集2010年3月至2010年8月的中山大学附属第一医院腹膜透析中心CAPD相关性腹膜炎患者32例。腹膜炎诊断标准参照2005年国际腹膜透析协会推荐指南。另收集55例CAPD无腹膜炎患者作为对照，记录患者人口学及血钾等实验室常规检查数据。流式细胞仪检测透出液中巨噬细胞表面Kv1.3。
　　 三、结果
　　 对照组和腹膜炎组患者平均年龄分别为49.9±14.9岁和51.7±15.3岁，男女比例分别为37:18和17:15，糖尿病肾病分别占24％和19％。对照组和腹膜炎组腹膜透析月分别为23.50±44.70和17.8±23.7。腹膜炎患者外周血白细胞、中性粒细胞百分比水平、红细胞、血红蛋白水平显著高于对照组(P<0.01或P<0.05)，两组血清白蛋白差异无统计学意义。
　　 低血钾主要发生在低白蛋白血症、低尿素氮等营养不良患者和长透析龄患者；未发现血钾与腹腔巨噬细胞Kv1.3的表达有相关性。与对照组比较，透出液巨噬细胞Kv1.3表达无统计学差异(平均荧光强度9.54±3.61 vs.8.78±2.30，P>0.05)。
　　 四、结论
　　 腹透相关性腹膜炎患者血钾水平显著下降，透出液巨噬细胞Kv1.3表达与非腹膜炎患者比较无显著改变。这一结果提示低钾参与腹透相关性腹膜炎的发生。然而低钾患者是否对腹膜炎增加易感性值得进一步随访观察。此外腹膜炎时是否外周血单个核细胞存在K.v1.3相关的免疫异常值得进一步研究。
　　 第二部分低钾对巨噬细胞功能影响的研究
　　 一、目的
　　 探讨低钾对巨噬细胞功能的影响
　　 二、方法
　　 小鼠巨噬细胞株Raw264.7常规培养，观察不同浓度钾培养基(5.4mM、2mM、4mM和10mM)对巨噬细胞活力(LDH和Annexin V-FITC凋亡检测)、吞噬功能(吞噬中性红及Alexa flunxa()488-E.coli)、杀菌能力(菌落形成单位杀菌实验)以及分泌炎性介质NO、IL-6和TNF-α的影响(流式细胞仪检测细胞内因子及ELISA)。
　　 三、结果
　　 1.不同浓度钾培养基对巨噬细胞活力的影响：
　　 1.1不同浓度钾培养基作用细胞不同时间培养上清乳酸脱氢酶(LDH)浓度变化：4h5.4mM钾浓度(生理钾浓度)组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组、10mM钾浓度组LDH分别为：6.47±0.27 U/L、6.55±0.16 U/L、6.33±0.52 U/L、6.54±0.18 U/L、；8h5.4mM钾浓度(生理钾浓度)组、2mM钟浓度组、4mM钾浓度组、10mM钾浓度组LDH分别为：7.18±0.84 U/L、7.34±0.32 U/L、7.51±0.27U/L、7.73±0.22 U/L；12h5.4mM钾浓度(生理钾浓度)组、2mM钟浓度组、4mM钾浓度组、10mM钾浓度组LDH分别为：14.84±2.07 U/L、15.00±1.58 U/L、14.57±2.4 U/L4、14.23±1.95 U/L；24h5.4mM钾浓度(生理钟浓度)组、2mM钾浓度组、4mM钟浓度组、10mM钾浓度组LDH分别为：19.62±3.52 U/L、17.93±2.20 U/L、18.45±2.39 U/L、20.61±3.36 U/L；以上各时间点不同钟浓度组间LDH水平均无显著性差异。
　　 1.2对细胞凋亡的影响：不同浓度钾培养基作用4h，5.4mM钟浓度(生理钾浓度)组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组、10mM钾浓度组细胞存活率分别为：95.49％±2.98％、96.00％+2.97％、95.51％±2.06％、96.79％±3.75％，各组之间无显著性差异；8h5.4mM(生理钾浓度)组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组、10mM钾浓度组存活率分别为：93.20％±3.81％、92.40％±5.65％、92.90％±7.83％、93.70％±6.01％，各组间无显著性差异；12h5.4mM(生理钟浓度)组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组、10mM钾浓度组细胞存活率分别为：91.90％±3.09％、87.76％±4.84％、89.20％±3.82％、93.94％±2.93％，与对照组比较，2mM钾浓度组细胞存活率显著下降(P<0.05)；与10mM钾浓度组比较，2mM钾浓度组和4mM钾浓度组细胞存活率均显著下降(P<0.01)；24h5.4mM(生理钾浓度)组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组、10mM钾浓度组细胞存活率分别为：88.74±2.72％、80.49％±1.67％：79.35％±9.58％、89.30％±5.77％，与对照组和10mM钾浓度组比较，4mM钟浓度组细胞存活率明显下降(P<0.05)。
　　 2.不同浓度钾培养基对巨噬细胞吞噬中性红的影响：不同浓度钾培养基作用4h，5.4mM钾浓度(生理钾浓度)组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组、10mM钾浓度组细胞中性红吸光度值分别为：0.21±0.02、0.15±0.01、0.19±0.01、0.22±0.01。2mM钾浓度组显著低于其他各组(P<0.01)，4mM钾浓度组显著低于10mM钾浓度组(P<0.01)。
　　 3.不同浓度钾培养基对巨噬细胞吞噬荧光细菌功能的影响：不同浓度钾培养基预刺激4h，5.4mM钾浓度(生理钾浓度)组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组和10mM钾浓度组巨噬细胞吞噬率分别为0.61±0.10、0.49±0.12、0.55±0.12和0.66±0.11。与对照组比较，10mM钾浓度组吞噬率显著升高(P<0.05)，吞噬指数分别为2.56±0.63、1.90±0.30、2.35±0.70、2.80±0.61；与10mM钾浓度组比较，2mM钾浓度组吞噬指数显著下降(P<0.01)。
　　 4.不同浓度钾培养基对巨噬细胞杀菌功能的影响：5.4mM钟浓度(生理钾浓度)组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组和10mM钾浓度组吞噬细菌30min CFU分别为：18.89±6.72x104、10.56±1.8 x104、13.31±6.50x104、27.23+9.24x104；各组孵育前后CFU差值为：12.92±5.32x104、5.64±2.53x104、9.42±7.05x104、17.64±5.64x104。与对照组比较，2mM钾浓度组吞噬细菌数及杀菌数减少显著(P<0.05)；与10mM钾浓度组比较，2mM钾浓度组和4mM钟浓度组吞噬细菌数及杀菌数减少显著(P<0.01)。
　　 5.不同浓度钾培养基对巨噬细胞分泌炎性介质的影响：
　　 5.4mM钾浓度(生理钾浓度)组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组和10mM钾浓度组NO水平分别为3.62±0.70μmol/L、3.69±0.65μmol/L、4.01±1.51μmol/L、8.73±0.45μmol/L。与对照组比较，10mM钟浓度组NO水平著升高(P<0.01)，2mM钾浓度组和4mM钾浓度组NO水平均无明显差异。与10mM钟浓度组比较，2mM钾浓度组和4mM钾浓度组NO水平显著低下(P<0.01或<0.05)。各组细胞IL-6浓度分别为：1.93±0.17 pg/ml、0.30±0.23 pg/ml、1.30±0.06 pg/ml、2.42±0.13 pg/ml。与对照组比较，2mM钾浓度组和4mM钾浓度组IL-6水平下降显著(P<0.01)、10mM钟浓度组IL-6水平明显增高(P<0.01)，其余各组之间IL-6水平差异显著(P<0.01)；各组IL-6阳性细胞数百分比分别为：30.37±6.37、21.37±2.23、27.83±3.34、33.85±3.85，2mM钾浓度组低于4mM组，显著低于正常生理组和10mM组，4mM组低于正常生理组和10mM组；各组细胞TNF-α浓度分别为：308.43±196.05 pg/ml、228.69±109.02 pg/ml、227.66±111.79 pg/ml、242.75±211.15 pg/ml。与对照组比较，其余各组TNF-α浓度均下降，但是均无统计学差异；各组TNF-α阳性细胞百分比中值分别为98.65、97.70、97.3、97.23；正常生理组显著高于其他各组(P<0.05)。
　　 四、结论
　　 低钾显著降低巨噬细胞活力、吞噬功能、杀菌功能及分泌细胞因子的功能。
　　 全文总结：
　　 1.腹透相关性腹膜炎患者血钾水平显著下降，透出液巨噬细胞Kv1.3表达与非腹膜炎患者比较无显著改变。提示低钾参与腹透相关性腹膜炎的发生。然而腹膜炎时是否外周血单个核细胞存在K.v1.3相关的免疫异常值得进一步研究。
　　 2体外研究发现：细胞外低钾可显著抑制巨噬细胞吞噬杀菌及分泌炎性介质的功能；相反，细胞外高钾浓度可增强巨噬细胞抵御能力。