炭疽病是由炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)引起的人兽共患传染病,曾多次被恐怖分子用来发动生物恐怖袭击。随着国际上生物战剂的研究发展和恐怖组织的活动频繁,炭疽越来越对人畜构成了威胁,因此建立快速、经济的分子分型方法,对预防和控制炭疽芽孢杆菌的大面积爆发和流行来说显得非常必要。 本研究对我国的炭疽芽孢杆菌进行了可变数目串联重复序列分析(Multiple LOCUS Variable-Number Tandem Repeats Analysis,MLVA)分析,初步探讨了可变数目串联重复(Variable Number Tandem Repeat,VNTR)位点在炭疽芽孢杆菌中的多态性,以及中国地区的主要流行菌株之间的遗传关系。 本文使用经典的苯酚氯仿方法,对全国各炭疽自然疫源地分离到的198株炭疽芽孢杆菌的基因组DNA进行了提取。利用Tandem Repeats Finder软件进行生物信息学分析后,最终选取了18个VNTR多态性位点。针对不同的VNTR多态性位点两端的基因组序列,设计了特异性荧光标记引物,PCR扩增后通过毛细管电泳检测。通过Genemarker软件确定PCR扩增片段长度,计算每个菌株不同串联重复位点拷贝数。采用Bionumerics软件分析,选用非加权组平均法(UPGMA)对炭疽芽孢杆菌进行聚类分析,研究炭疽芽孢杆菌菌株之间的遗传差异。 结果表明:使用18个串联重复位点进行UPGMA聚类分型,可鉴定出96个基因型。按遗传学距离归纳为2个集群A和B,共分为4个组A1,A2,B1,B2。A1组可划分为两个亚组A1.a,A1.b,B1组可划分为两个亚组B1.a,B1.b。B2组也可划分为两个亚组B2.a,B2.b。炭疽芽孢杆菌分布主要集中在A1.b亚群以及B1组和B2组中。A1.b亚群主要分布的基因型为4、18和31,B1组主要分布的基因型为57、59、68、77和78,B2组主要分布的基因型为84和92。VNTR多态性位点多态性信息含量分析结果显示,Barns1、Bams34、A031、Bams3、VrrC1、.Bams30、VrrC2、Bams31八个VNTR多态性位点具有较高的多态性,确定了一个新的VNTR多态性位点A031。选用这八个多态信息含量最高位点进行组合后对炭疽芽孢杆菌进行UPGMA聚类分析,可鉴定出66个基因型。 本论文的初步研究结果将对推动我国炭疽芽孢杆菌的分子分型,保障我国在生物防控领域的监控水平,起到积极的推动作用。
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