DJ-1低表达对心肌细胞缺氧预适应延迟保护影响的研究

摘要

目的：构建靶向DJ-1的RNAi真核表达载体，观察DJ-1低表达对心肌细胞缺氧预适应(APC)延迟保护的影响，以求反向阐明DJ-1是否作为内源性保护蛋白通过其抗氧化应激作用参与心肌细胞APC延迟保护。
　　 方法：1、设计靶向DJ-1基因的3条候选RNA干扰序列，利用真核表达载体pGPU6/GFP/Neo构建重组质粒，瞬时转染H9c2心肌样细胞后，RT-PCR和Western Blot检测DJ-1mRNA和蛋白表达，筛选最有效的RNA干扰靶片段用于后续细胞实验；
　　 2、H9c2心肌样细胞随机分为5组：①正常对照(Control)组；②pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1+Control组；③缺氧/复氧(A/R)组；④缺氧预适应(APC)组；⑤pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1+APC组。实验处理后，通过RT-PCR和Western Blot检测DJ-1mRNA及蛋白表达；MTT法检测细胞存活率；按试剂盒说明测定各组细胞内LDH的活性，比色法测定细胞内MDA含量以及抗氧化物酶SOD、CAT、GSH-Px的活性；流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)含量；分析DJ-1基因沉默前后APC对上述指标影响的变化。
　　 结果：1、经酶切及DNA测序鉴定证实成功构建了各重组RNA干扰真核表达载体包括靶向DJ-1基因的3个候选重组载体pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-A，B，C及阴性对照pGPU6/GFP/Neo-sh-NC。此外，RT-PCR和Western Blot检测结果显示pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-B重组载体瞬时转染抑制靶基因表达的效果最强，H9c2细胞中DJ-1 mRNA和蛋白表达的抑制率均在75％以上；
　　 2、H9c2细胞经A/R处理后，细胞存活率明显下降、LDH活性增加；细胞内MDA及ROS含量显著增加，抗氧化物SOD、CAT、GSH-Px的酶活性下降，与Control组比较均有显著性差异(p<0.01)，表明H9c2细胞经A/R处理出现明显的氧化应激损伤。而H9c2细胞预先经APC处理后，显著提高了A/R损伤心肌细胞的生存率，并显著抑制LDH的活性；同时，APC减少A/R心肌细胞内MDA、ROS含量，增加内源性抗氧化酶SOD、GSH-Px、Catalase活性，表明在H9c2细胞水平上APC能对抗A/R所诱发的氧化应激，产生延迟保护。此外，结果发现：APC在对抗A/R所诱发的氧化应激，产生延迟保护的同时，明显上调了DJ-1mRNA及蛋白表达，而RNAi沉默DJ-1基因表达后，APC上述效应被逆转。
　　 结论：1、成功构建了靶向DJ-1基因的RNAi真核表达载体，为进一步研究DJ-1蛋白功能、探讨DJ-1在心肌I/R损伤保护中的作用及机制奠定基础；2、DJ-1作为内源性保护蛋白通过其抗氧化应激作用参与了心肌细胞缺氧预适应延迟保护。