脑血管痉挛中缝隙连接蛋白Cx43、Cx40磷酸化水平及其磷酸化位点分析

摘要

目的：
　　 心脑血管系统中主要表达和起作用的缝隙连接蛋白为Cx43和Cx40，其磷酸化在许多心脑血管疾病中扮演着重要角色。本实验在前期研究的基础上，分析脑血管痉挛中缝隙连接蛋白Cx43、Cx40的磷酸化水平并利用质谱技术筛选出其磷酸化位点。为更深入研究缝隙连接蛋白Cx43、Cx40磷酸化参与蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管痉挛(CVS)的机制奠定坚实的基础，并为下一步筛选出对CVS有效药物提供靶点。
　　 方法：
　　 1、ET-1诱导的SD大鼠脑基底动脉血管条CVS模型的建立：采用同种系SD大鼠，麻醉后断头取脑，显微镜下分离脑基底动脉，将其剪成完整的动脉条，400pmolET-1孵育动脉条，建成ET-1诱导的SD大鼠脑基底动脉血管条CVS模型。
　　 2、CVS模型的检测：分为ET-1刺激组和正常组，比对ET-1刺激后血管条发生的张力变化。
　　 3、CVS组和正常组中Cx43、Cx40磷酸化水平的分析：利用磷酸化蛋白富集试剂盒富集CVS组和正常组中的磷酸化总蛋白，再利用Western Blotting技术分析CVS组和正常组中Cx43、Cx40磷酸化水平的改变。
　　 4、CVS中Cx43、Cx40磷酸化位点的检测：利用串联质谱技术对CVS中Cx43、Cx40磷酸化位点进行分析，筛选出CVS中Cx43、Cx40发生磷酸化的位点。
　　 结果：
　　 1、成功建立ET-1诱导的SD大鼠脑基底动脉血管条CVS模型，血管条张力检测发现，ET-1刺激后血管条张力发生明显的改变。
　　 2、正常脑基底动脉中Cx43、Cx40都处于相对较低的磷酸化水平，但与Cx43相比，Cx40处于相对较高的的磷酸化水平。
　　 3、CVS后Cx43、Cx40磷酸化水平明显升高，然而比较Cx43、Cx40磷酸化蛋白表达量发现CVS中磷酸化GJ蛋白的表达主要以Cx40为主。
　　 4、前期我们研究表明正常脑基底动脉平滑肌层的GJ蛋白主要为Cx40，CVS后则以Cx43的表达为主，结合本实验结果我们发现：CVS后脑基底动脉平滑肌中总蛋白的表达主要为Cx43，而磷酸化蛋白的表达则以Cx40为主。
　　 5、对CVS中Cx43与Cx40进行磷酸化位点检测，分别筛选出Cx40的9个磷酸化位点和Cx43的4个磷酸化位点。
　　 结论：
　　 CVS后这种总蛋白与磷酸化蛋白表达的不一致可能在CVS的病理过程中起到重要作用。并且筛选出来的Cx40的9个磷酸化位点和Cx43的4个磷酸化位点可能是导致CVS后GJ功能发生改变的关键，并由此影响到CVS的发生与发展。