HMME介导的光动力疗法治疗骨与软组织肉瘤的疗效及机理研究

摘要

目的：探讨血卟啉单甲醚介导光动力疗法(HMME-PDT)的抗肉瘤效应及其机理。
　　方法：体外实验中，流式细胞术检测骨肉瘤细胞(LM8)和成肌细胞(C2C12)在不同孵育时间及不同浓度HMME作用下胞内光敏剂的摄取量;MTT法检测HMME的在LM8细胞中的最佳孵育时间及对多株肉瘤细胞存活率的影响，流式细胞术检测骨肉瘤细胞凋亡率，Hoechst33342染色法观察细胞凋亡;实时荧光定量PCR(QRT-PCT)检测caspase-3、Bcl-x、 p53和RelA mRNA相对表达量;蛋白免疫印迹(Western blotting)检测肿瘤细胞中caspase-1、-3、-6、-9、PARP、Bcl-x、p53及RelA蛋白相对表达量;不可逆caspase通路抑制剂(Z-VAD-FMK)及坏死抑制剂(Nec-1)检测PDT介导的细胞死亡形式。体外实验中，建立小鼠骨肉瘤模型，测定瘤体体积及瘤重评估PDT的抗肿瘤效应;hematoxylin-eosin(HE)染色检测肿瘤组织形态学改变;免疫组化法（Immunohistochemistry，IHC）caspase-1、-3、-6、-9和PARP在肿瘤组织中的表达。
　　结果：光敏剂HMME选择性的聚集于骨肉瘤细胞中，而正常细胞摄取较少，且在骨肉瘤细胞中的摄取呈现孵育时间及浓度依赖性。HMME在肉瘤细胞内的最佳孵育时间为4小时，HMME-PDT能显著杀伤骨与软组织肉瘤细胞，且杀伤效应随着HMME浓度及能量密度的增高而增强。HMME-PDT可显著诱导贴壁及悬浮培养骨肉瘤细胞发生凋亡。Hoechst33342染色观察到典型的凋亡改变（核固缩、细胞变圆等）。QRT-PCT及Western blotting结果显示:HMME-PDT可显著上调caspase-3mRNA和蛋白相对表达量，而HMME-PDT可明显下调Bcl-x、p53、RelA mRNA和蛋白相对表达量;凋亡是HMME-PDT介导的细胞死亡的主要形式，且与caspase依赖的凋亡通路密切相关。HMME-PDT组肿瘤体积及瘤重均较空白组相比显著减小;肿瘤区域出现广泛坏死;HMME-PDT组小鼠肿瘤组织caspase-1、-3、-6、-9、PARP蛋白表达量显著上调。
　　结论：HMME选择性的聚集于骨与软组织肉瘤细胞中，而正常细胞摄取较少;HMME-PDT对肉瘤细胞有显著的杀伤效应，且随着HMME浓度及能量密度的增高而增强;HMME-PDT诱导肉瘤细胞发生凋亡是其重要的杀伤机制;HMME-PDT能有效的抑制肉瘤的生长，其抗肉瘤效应与caspase依赖的凋亡通路密切相关。

目录

声明

摘要

中英文对照缩略词

第1章 引言

第2章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验细胞株

2．1．2 实验动物

2．1．3 试剂及耗材

2．1．4 主要试剂及配置方法

2．2 实验方法

2．2．1 细胞传代培养

2．2．2 细胞计数

2．2．3 光敏剂HMME摄收实验

2．2．4 MTT法检测HMME在肉瘤细胞中最佳孵育时间

2．2．5 MTT法检测肉瘤细胞存活率

2．2．6 荧光倒置显微镜下观察细胞形态

2．2．7 AnnexinV-FITC／PI法检测骨肉瘤细胞凋亡

2．2．8 HMME-PDT对悬浮培养细胞的影响

2．2．9 Hoechst33342染色法观察细胞凋亡

2．2．10 QRT-PCR检测HMME-PDT诱导的相关凋亡基因表达情况

2．2．11 蛋白提取及定量

2．2．12 Western blotting检测初筛caspase-3、Bcl-x、p53、RelA蛋白相对表达

2．2．13 Western blotting检测caspase-1、3、6、9和PARP蛋白相对表达

2．2．14 MME-PDT介导的细胞死亡

2．2．15 动物模型制备

2．2．16 观察PDT在动物模型中的抗肿瘤效应

2．3 统计学方法

第3章 实验结果

3．1 HMME选择性聚集于骨肿瘤细胞

3．2 HMME在肉瘤细胞中的最佳孵育时间

3．3 HMME-PDT抑制骨肿瘤细胞存活率

3．4 镜下细胞形态学变化

3．5 HMME-PDT诱导贴壁骨肉瘤细胞凋亡

3．6 HMME-PDT诱导悬浮培养骨肉瘤细胞凋亡

3．7 Hoechst33342染色法观察到骨肉瘤细胞凋亡

3．8 QRT-PCR检测各凋亡基因mRNA表达水平

3．9 Western blotting初筛检测caspase-3、Bcl-x、p53、RelA蛋白相对表达情况

3．10 Z-VAD-FMK及Nec-1检测HMME-PDT介导细胞死亡

3．11 Western blotting检测caspase-1、3、6、9和PARP蛋白相对表达情况

3．12 HMME-PDT对鼠骨肉瘤抑制实验

3．13 HE染色观察肿瘤组织形态学改变

3．14 免疫组化检测小鼠肿瘤经HMME-PDT处理后caspase-1、3、6、9和PARP表达

第4章 讨论

第5章 结论及展望

5．1 结论

5．2 展望

致谢

参考文献

综述 光动力疗法在骨肿瘤基础及临床方面的研究进展

在读期间研究成果