Slo3通道对小鼠精子Ca2+信号作用的研究

摘要

研究背景和目的:不育不孕症是影响人类繁衍和心理健康的一种重要临床疾病，其中约有一半的病因在于男性。精子是男性生育最重要的因素之一，由睾丸生成，它逐渐成熟后贮存在附睾内，但此时的精子是不具有授精能力。精子进入雌性生殖道后，随着理化环境（pH值、渗透压和化学成份等）的改变，会经历获能、超活化和顶体反应等生理过程，最终完成授精。这些生理过程是精子功能必不可少的部分，对精子完成授精至关重要。
　　与在其它细胞相似，Ca2+作为精子细胞的第二信使扮演着重要的角色，其直接或者间接调控精子获能、超活化和顶体反应等重要生理过程。Ca2+通过精子细胞膜上的Ca2+通道流入细胞中。目前利用电生理技术在小鼠精子上检测到电流只有两种，一是由CatSper通道介导的Ca2+电流;另一是由Slo3通道介导的K+电流。已经有研究表明小鼠精子上最主要的K+离子通道——Slo3在精子的获能过程中具有重要作用。随着精子胞内碱化，精子膜上的pH依赖的Slo3通道随之开放，导致细胞膜电位超极化。膜电位超极化可能通过两方面影响精子Ca2+信号:一方面增加Ca2+内流的驱动力使Ca2+内流增多;另一方面降低电压依赖的CatSper通道开放概率而减少Ca2+内流。尽管推断Slo3通道是精子Ca2+信号的重要调节,但其单独对的Ca2+信号作用尚不明确。在诸多的Slo1通道特异的以及广泛的K+通道阻断剂中，如CTX、 IbTX、TEA、4-AP以及奎尼丁等，只有奎尼丁能强效抑制Slo3通道。
　　另外活性氧物质(Reactive oxygen species，ROS)对小鼠精子功能也具有影响作用。虽然适量的ROS与精子正常生理功能密切相关，但是ROS过量时会引起细胞氧化-抗氧化失衡，对精子造成严重的损伤，降低精子活性、抑制顶体反应、严重影响精子的授精能力。ROS对精子造成的损伤与Slo3-/-精子的表型非常相似，另外已知ROS对Slo1通道有抑制作用，而Slo3与Slo1在结构上非常相似，基于这些相似性我们推断ROS可能通过作用于Slo3通道而对精子胞内Ca2+信号有影响作用。通过本课题的研究希望探索到男性不育与Slo3通道的相关病因，以及为开发新型、安全、有效的男性避孕药提供理论依据。
　　方法:一、利用荧光共聚焦Ca2+成像技术，对三个月以上的雄鼠精子处理后进行实验;对细胞进行以下处理:空白对照组（Ctrl）、奎尼丁处理组（Ctrl+Qui）、过氧化氢(H2O2)处理组，随机选取三个月以上的雄性小鼠。实验内容:1、取小鼠附睾尾部分装在离心管中离心;2、将离心后的精子分置在已经涂有Cell-Tak和Poly-L-lysine hydrobromide等试剂的容器中，并使细胞充分贴壁;3、在精子充分贴壁的容器中加入Fluo-4 AM染料，在保证室温、避光等实验条件下使细胞染色30分钟;4、将黏贴有精子的容器充分清洗后，在60倍油镜下观察精子给药后的荧光变化，激发光波长488 nm，接收波长535-565 nm。
　　二、利用膜片钳技术:在全细胞模式下充分研究奎尼丁对KSper的抑制，预期找到奎尼丁阻断精子本身K+电流的剂量-效应关系。
　　结果:1、奎尼丁会使精子细胞Ca2+信号降低，并且这种降低作用与奎尼丁浓度呈正相关，即随着奎尼丁浓度的增加，其对精子Ca2+信号的抑制作用也增加。奎尼丁实验浓度分别为0.1μM、1μM、10μM、100μM和1000μM，加药后观察到精子细胞Ca2+信号都下降，0.1μM浓度的奎尼丁可以引起精子内Ca2+信号降低约16％;1μM浓度的奎尼丁可以引起精子内Ca2+信号发生大约28％的下降;10μM浓度的奎尼丁就可以引起精子内Ca2+信号发生更大的变化，大约降低45％;而100μM及1000μM浓度的奎尼丁引起精子细胞Ca2+信号降低的幅度更大，分别约73％和90％。信号下降一般的药物浓度(IC50)大约是11μM。有趣的是奎尼丁抑制KSper的IC50大约是10μM。
　　2、我们初步的数据表明H2O2也影响精子Ca2+信号。但与奎尼丁不同的是，过氧化氢在低浓度时表现出对精子Ca2+信号的促进作用;在高浓度时则表现出较大的抑制作用。过氧化氢实验浓度分别为100μM、1000μM、1×106μM，100μM浓度的H2O2使精子细胞Ca2+信号增加约30％，而1000μM和1×106μM浓度的H2O2则使精子细胞Ca2+信号分别下降60％和90％左右。H2O2对精子Ca2+信号的影响是否与Slo3通道相关还需要更深入的研究。
　　结论:当Slo3通道被奎尼丁抑制时精子细胞内Ca2+浓度降低，提示受碱性激活Slo3通道开放时其净作用将增加细胞Ca2+的内流。

目录

声明

摘要

第1章 引言

1．1 概述

1．2 精子的结构

1．2．1 头部

1．2．2 尾部

1．3 精子的发生和成熟

1．3．1 精子发生

1．3．2 精子成熟

1．4 精子获能

1．4．1 获能概念

1．4．2 获能过程

1．4．3 获能过程中精子发生的变化

1．5．精子超活化运动

1．5．1 精子获能后运动方式明显改变

1．5．2 精子运动的检测方法

1．6 精子授精功能

1．6．1 精卵识别

1．6．2 顶体反应

1．7 Ca2+对精子功能的作用

1．7．1 CA2+在精子成熟过程中的作用

1．7．2 Ca2+对精子运动的作用

1．7．3 Ca2+与精子获能

1．7．4 Ca2+在顶体反应中的作用

1．7．5 精子胞内Ca2+两大来源

1．7．6 精液中的Ca2+测定

1．8 精子上主要的离子通道

1．8．1 Ca2+通道

1．8．2 K+通道

1．8．3 HV1通道

1．8．4 离子通道与精子的生理功能

1．9 Slo3与精子细胞Ca2+信号

1．9．1 Slo3与Ksper

1．9．2 Slo3与精子细胞Ca2+信号

1．9．3 奎尼丁是Slo3通道的强效阻断剂

1．9．4 H2O2可能影响精子功能

1．10 研究的目的和意义

第2章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 溶液配制

2．2．2 细胞处理

2．2．3 药物浓度

2．2．4 膜片钳检测奎尼丁对KSper的影响

2．2．5 荧光共聚焦单细胞Ca2+测定

2．2．6 数据表达

2．2．7 数据分析

第3章 结果

3．1 膜片钳检测奎尼丁(Quinidine)对精子KSper的作用

3．2 不同浓度的奎尼丁(Quinidine)对精子Ca2+信号的影响

3．2．1 8-Br-cAMP对精子Ca2+信号的影响

3．2．2 0．1 μM浓度的奎尼丁使精子Ca2+信号平均降低16％

3．2．3 1μM浓度的奎尼丁使精子Ca2+信号平均降低28％

3．2．4 10 μM浓度的奎尼丁使精子Ca2+信号平均降低45％

3．2．5 100 μM浓度的奎尼丁使精子Ca2+信号平均降低73％

3．2．6 1000 μM浓度的奎尼丁使精子内Ca2+信号平均降低90％

3．2．7 奎尼丁抑制Ca2+信号的量效关系拟合

3．3 不同浓度的过氧化氢(H2O2)对精子Ca2+信号的影响

3．3．1 100 μM浓度的H2O2对精子细胞Ca2+信号的影响

3．3．2 1000 μM浓度的H2O2对精子细胞Ca2+信号的影响

3．3．3 1×106 μM浓度的H2O2对精子细胞Ca2+信号的影响

3．3．4 不同浓度的H2O2对精子细胞Ca2+信号影响的比较

第4章 讨论

4．1 奎尼丁对精子细胞Ca2+信号的影响

4．2 过氧化氢对精子细胞Ca2+信号的影响

第5章 结论

致谢

参考文献

综述 调控精子功能的离子通道