ApoE基因多态性对氟伐他汀抑制HMg-CoA还原酶影响及分子机制的研究

摘要

背景：ApoE是血浆脂蛋白的重要成分，通过与LDL受体结合调节着体内的血脂水平。临床研究报道，ApoE的基因多态性对他汀类药物调节血脂的疗效有明显影响;而另有研究结果则提示阿托伐他汀调脂效应的差异似与ApoE基因多态性无关，孰是孰非尚需更多的研究证据予以评判。值得重视的是，ApoE与LDL受体结合参与体内脂质代谢，而他汀类药物抑制胆固醇合成的限速酶----HMG-CoA还原酶调节血脂，两条完全不同的作用途径如何产生影响和关联更加令人关注。因此，我们试图以ApoE基因多态性为切入点，运用细胞学和分子生物学的研究方式，探究ApoE的基因多态性对他汀类药物调脂效应的确切影响及其分子机制，为他汀类药物调血脂作用的研究拓展新思路。
　　目的：通过比较不同基因亚型ApoE与LDL竞争性结合的差异，分析ApoE调脂效应的作用位点;采用RT-PCR检测HMG-CoA还原酶mRNA表达，比较不同基因亚型ApoE对氟伐他汀、丹参素及两者联合应用抑制HMG-CoA还原酶的影响;探讨ApoE基因多态性对氟伐他汀抑制HMG-CoA还原酶的确切影响位点及分子机制。
　　方法：⑴ApoE竞争性结合实验:建立HSF细胞模型，系统摸索LDL与LDL受体结合时间、LDL浓度等最佳实验条件;制备不同基因亚型的ApoE-DMPC复合体;建立ELISA检测方法，用来检测不同基因亚型ApoE-DMPC复合体与LDL竞争性结合而置换的LDL量。⑵HMG-CoA还原酶mRNA表达实验:建立L-02细胞模型，系统摸索细胞培养血清、药物作用时间和ApoE浓度等最佳实验条件;采用RT-PCR检测L-02细胞中HMG-CoA还原酶mRNA表达量，表达量以灰度值比表示。⑶通过ApoE竞争性受体结合实验，观察ApoE2（Arg112→Cys）(突变型E2)、ApoE3(野生型E3)、ApoE4（Cys158→Arg）（突变型E4）三种基因亚型ApoE-DMPC复合体与LDL竞争性结合活性的差异。⑷通过RT-PCR检测HMG-CoA还原酶mRNA表达量，考察野生型E3、突变型E2、突变型E4三种基因亚型分别对氟伐他汀、丹参素、氟伐他汀与丹参素联合应用抑制HMG-CoA还原酶表达的影响;综合分析ApoE基因多态性对氟伐他汀抑制HMG-CoA还原酶影响的位点及分子机制。⑸数据处理与统计分析。通过双倒数作图法计算IC50;抑制率=（空白组灰度值比-实验组灰度值比）/空白组灰度值比×100％;所有数据均以平均数±标准差（mean±SD）表示，统计分析采用SPSS软件进行数据处理，多样本组间差异采用方差齐性检验，两两比较采用独立样本t检验。统计结果以P＞0.05表示差异无统计学意义，P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有极显著性差异。
　　结果：①本研究建立的ELISA检测LDL方法灵敏度高，精密度、准确度均符合实验要求。线性范围为0.2-12.8μg/ml。竞争性受体结合实验的最佳结合时间为120min、LDL与受体的结合量为1.59±0.07μg/mg protein。LDL在浓度范围为2-50μg/ml时与受体的结合量呈线性增加。②血清培养的L-02细胞中，RT-PCR检测HMG-CoA还原酶mRNA表达灰度值比为0.38±0.02，无血清诱导24h后的灰度值比上升到0.86±0.01。而氟伐他汀作用L-02细胞24h时，HMG-CoA还原酶mRNA灰度值比0.49±0.01。最适实验条件为血清培养24h。野生型E3、突变型E2、突变型E4的实验浓度分别为0.36、0.50、0.63μg/ml。③野生型E3、突变型E2、突变型E4三种基因亚型与LDL竞争性结合的LDL最大置换量分别为6.84±0.23，3.92±0.40，6.30±0.32μg/mg protein;IC50分别为0.05±0.01，0.35±0.02，0.24±0.01μg/ml，方差齐性检验显示三组间有显著性差异(P＜0.05)，突变型E2、E4与野生型E3两两比较，差别有统计学差异(P＜0.01，P＜0.01)，两种突变型E2、E4受体结合活性低于野生型E3，且突变型E2受体结合活性低于突变型E4(P＜0.01)。④系列浓度的氟伐他汀、丹参素对HMG-CoA还原酶mRNA表达抑制的IC50分别为1.62±0.11、3.00±0.14;IC50对应的HMG-CoA还原酶表达的抑制率分别为24.13±0.20％、15.11±0.31％;最大抑制率分别为48.26±0.40％、30.21±0.62％，可见氟伐他汀、丹参素均能显著抑制HMG-CoA还原酶，且氟伐他汀抑制作用更强，差异有统计学意义(P＜0.01)。合用1.62μg/ml氟伐他汀与3.00μg/ml丹参素时，看到其对HMG-CoA还原酶mRNA表达的抑制率为34.61±0.45％，比单用氟伐他汀（24.13±0.20％）、单用丹参素（15.11±0.31％）的酶抑制率明显增大，t检验显示差异显著(P＜0.01);明确的显示了抑制HMG-CoA还原酶活性的协同效应。⑤当加入野生型E3、突变型E2和E4时，氟伐他汀（IC50浓度1.62μg/ml）对HMG-CoA还原酶的抑制率分别为18.59±1.09％、23.49±0.37％、12.13±0.91％，均小于未加入ApoE组。将野生型E3组与未加ApoE相比，其HMG-CoA还原酶抑制率有统计学差异(P＜0.01);而突变型E2组和突变型E4组的差异则不相同(P＞0.05，P＜0.01);突变型E4组与野生型E3组二者比较显示氟伐他汀对HMG-CoA还原酶抑制率差异具有统计学意义(P＜0.01);由此可见，ApoE2112位Arg突变为Cys似与氟伐他汀对HMG-CoA还原酶抑制率的变化无关。当加入野生型E3、突变型E2和E4时，丹参素(IC50，3.00μg/ml)对HMG-CoA还原酶mRNA表达的抑制率分别为9.94±1.05％、6.54±0.47％、22.46±1.21％。野生型E3组和突变型E2组HMG-CoA还原酶抑制率小于未加ApoE组，差异均有显著统计学意义(P＜0.01);而突变型E4组的结果则相反: HMG-CoA还原酶明显增大，与野生型E3组比较具有显著统计学意义(P＜0.01，P＜0.01);由此可见，ApoE4158位Cys突变似可增强丹参素对HMG-CoA还原酶的抑制效应。⑥当加入野生型E3、突变型E2和E4时，联合作用1.62μg/ml氟伐他汀与3.00μg/ml丹参素对HMG-CoA还原酶mRNA表达的抑制率分别为24.68±2.63％、11.08±1.38％、33.69±1.65％。野生型E3组和突变型E2组HMG-CoA还原酶抑制率小于未加ApoE组;差异均有显著统计学意义(P＜0.01);而突变型E4组的比较结果差异无统计学意义(P＞0.05)，这可能与ApoE4158位Cys突变增强丹参素抑酶效应有关。
　　结论：⑴ApoE2112位Arg（精氨酸）突变为Cys（半胱氨酸）及ApoE4158位Cys突变为Arg均会导致受体结合活性比野生型E3更低，但突变型ApoE2与野生型E3之间的差异比突变型E4与野生型E3之间的差异更大，突变型E2与突变型E4之间差异有统计学差异。提示112位为ApoE的主要突变位点。⑵氟伐他汀与丹参素均有抑制HMG-CoA还原酶表达的作用，且氟伐他汀比丹参素抑制作用更强;氟伐他汀与丹参素联合应用时抑制HMG-CoA还原酶具有协同效应。⑶氟伐他汀抑制HMG-CoA还原酶mRNA表达作用与ApoE2112位Arg突变为Cys无关，丹参素抑制HMG-CoA还原酶mRNA表达作用与ApoE4158位Cys突变为Arg有关联;与无ApoE相比，突变型E2、突变型E4存在时，氟伐他汀与丹参素抑制酶表达作用大部分表现为减小。由此可以推论，ApoE112和158位点的突变而导致的LDL置换量的降低会减小氟伐他汀及丹参素对HMG-CoA还原酶表达的抑制作用。⑷实验结果进一步说明，氟伐他汀与丹参素联合应用时，野生型E3组和突变型E2组HMG-CoA还原酶抑制率小于未加ApoE组;而突变型E4组与无ApoE时差异无统计学意义。这可能与ApoE4158位Cys突变增强丹参素抑酶效应有关。⑸ApoE112位和158位基因突变时，均会导致氟伐他汀与丹参素抑制HMG-CoA还原酶的作用发生变化。故氟伐他汀与丹参素在临床用药时应密切关注患者ApoE不同位点的突变情况。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 ApoE不同基因亚型与LDL竞争性结合LDL-r实验

2．1 材料

2．1．1 人皮肤成纤维细胞(HSF)株

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 ApoE-DMPC复合物制备

2．2．2 HSF细胞培养

2．2．3 ApoE与LDL竞争性结合HSF细胞LDL-r试验

2．2．4 统计分析

2．3 结果

2．3．1 HSF培养

2．3．2 ApoE与LDL竞争性结合HSF细胞LDL受体试验结果

2．4 讨论

第3章 ApoE基因多态性对氟伐他汀抑制HMG-CoA还原酶mRNA表达的影响

3．1 材料

3．1．1 人胚肝细胞L-02细胞株

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 溶液配制

3．2．2 L-02细胞的培养

3．2．3 L-02细胞生长曲线绘制

3．2．4 MTT法检测药物对L-02细胞的增殖抑制作用

3．2．5 RT-PCR

3．2．6 血清对L-02细胞HMG-CoA还原酶mRNA表达的影响

3．2．7 药物作用时间对L-02细胞HMG-CoA还原酶mRNA表达抑制的影响

3．2．8 ApoE浓度对L-02细胞中HMG-CoA还原酶mRNA表达抑制的影响

3．2．9 氟伐他汀浓度对L-02细胞中HMG-CoA还原酶mRNA表达抑制的影响

3．2．10 ApoE不同基因亚型对氟伐他汀抑制HMG-CoA还原酶mRNA表达的影响

3．2．11 ApoE不同基因亚型对氟伐他汀与丹参素联合抑制HMG-CoA还原酶mRNA表达的影响

3．2．12 统计分析

3．3 结果

3．3．1 L-02细胞培养

3．3．2 L-02细胞生长曲线

3．3．3 MTT法检测药物对L-02细胞的增殖抑制作用

3．3．4 RNA纯度及完整性鉴定

3．3．5血清对L-02细胞HMG-CoA还原酶mRNA表达的影响

3．3．6 药物作用时间对L-02细胞中HMG-CoA还原酶mRNA表达抑制的影响

3．3．7 ApoE浓度对L-02细胞中HMG-CoA还原酶mRNA表达抑制的影响

3．3．8 氟伐他汀浓度对L-02细胞中HMG-CoA还原酶mRNA表达抑制的影响

3．3．9 ApoE不同基因亚型对氟伐他汀抑制HMG-CoA还原酶表达的影响

3．3．10 ApoE不同基因亚型对氟伐他汀与丹参素联合抑制HMG-CoA还原酶表达的影响

3．3．11 氟伐他汀丹参素联合应用与单独作用对HMG-CoA还原酶mRNA表达抑制作用统计分析

3．4 讨论

第4章 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述 载脂蛋白E基因多态性对调血脂药临床疗效的影响