Notch1信号通路在H9c2心肌细胞缺血后处理中对细胞凋亡作用的实验研究

摘要

目的:
　　探讨Notch1信号通路在H9c2心肌细胞缺血后处理心肌保护中对细胞凋亡的影响，为防治心肌缺血再灌注损伤提供新靶点。
　　方法:
　　采用大鼠H9c2心肌细胞构建缺氧复氧模型（H/R）和缺氧后处理模型(H-post)，脂质体法转染pcDNA3.1-Myc-His质粒和pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRNA干扰质粒，上调和下调Notch1信号，将H9c2心肌细胞随机分为6组:Control组，H/R组，N1ICD+H/R组，H-post组，miRNA+H-post组，Mock组。采用流式细胞技术检测各组细胞凋亡率，real-time PCR和Western-blotting检测凋亡基因蛋白Bcl-2和Bax表达变化情况，caspase活性检测试剂盒检测caspase-9活性和caspase-3活性。探讨Notch1信号通路在心肌缺氧后处理心肌保护中对大鼠心肌细胞凋亡的影响。
　　结果:
　　1.流式细胞术检测细胞凋亡率测定:与Control组相比，H/R组细胞凋亡率显著升高（6.21±0.98％和0.8±0.12％），两者有显著统计学差异(P＜0.05);当N1ICD质粒转染上调Notch1信号表达后，N1ICD+H/R组与H/R组相比细胞凋亡率明显下降（3.10±0.17％和6.21±0.98％），两者有显著统计学差异(P＜0.05);H-post组细胞凋亡率与H/R组相比下降明显（1.98±0.18％和6.21±0.98％），有显著统计学差异(P＜0.05);miRNA干扰下调Notch1信号表达后，miRNA+H-post组与H-post组相比，细胞凋亡率明显增高（6.30±0.26％和1.98±0.18％），有显著统计学差异(P＜0.01)。
　　2.凋亡基因蛋白Bcl-2和Bax的表达情况:real-time PCR检测凋亡基因Bcl-2mRNA和Bax mRNA表达水平:H/R组与Control组相比，Bax mRNA表达显著增加(P＜0.05)，Bcl-2 mRNA表达显著降低(P＜0.05);H-post组与H/R组相比Bax mRNA表达水平显著降低(P＜0.05)，Bcl-2 mRNA显著增加(P＜0.05);miRNA+ H-post组与H-post组相比，Bax mRNA明显高，而Bcl-2mRNA明显降低(P＜0.01); N1ICD+H/R组与H/R组相比Bax mRNA表达水平显著降低(P＜0.05)，Bcl-2 mRNA显著增加(P＜0.05)。通过Western-blotting检测其蛋白表达情况，蛋白表达与相应mRNA表达相一致。
　　3.Caspase活性检测结果:与Control组相比，H/R组caspase-9和caspase-3活性明显增高(P＜0.05)，通过N1 ICD质粒转染，上调Notch1信号表达，N1ICD+H/R组与H/R组相比，N1ICD+H/R组caspase-9和caspase-3活性显著降低(P＜0.05)，H-post组与H/R组相比，H-post组caspase-9和caspase-3活性明显降低(P＜0.05)，通过miRNA干扰下调Notch1信号表达，miRNA+H-post组与H-post组相比，miRNA+H-post组caspase-9和caspase-3活性明显增高(P＜0.05)。
　　结论:
　　Notch1信号通路可通过抑制细胞凋亡线粒体途径，减轻细胞凋亡的发生，在心肌缺氧后处理中起到心肌保护作用。

目录

声明

摘要

中英缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2．1 细胞株

2．2 pcDNA3．1-Myc-His质粒和pcDNATM 6．2-GW／EmGFP-miRNA质粒

2．2．1 Notch1胞内结构域真核表达质粒

2．2．2 Notch1 miRNA干扰质粒

2．3 实验试剂

2．3．1 主要购买试剂

2．3．2 主要配置试剂

2．4 实验仪器

2．5 方法

2．6 大鼠心肌细胞H／R和H-post模型的制备

2．7 细胞转染

2．8 实验分组

2．9 流式细胞技术检测心肌细胞凋亡

2．10 real-time PCR检测凋亡基因Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达变化

2．10．1 引物设计

2．10．2 H9c2心肌细胞总RNA提取

2．10．3 H9c2心肌细胞总RNA逆转录为cDNA

2．10．4 real-time PCR检测Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达变化

2．11 Western-blotting技术检测凋亡基因蛋白Bcl-2和Bax表达变化

2．12 caspase蛋白活性测定

2．13 统计学分析

第3章 实验结果

3．1 细胞转染后荧光显微镜下观察

3．2 流式细胞术检测细胞凋亡

3．3 凋亡基因Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达结果变化

3．4 Bcl-2和Bax凋亡蛋白表达结果变化

3．5 caspase-9和caspase-3活性表达变化

第4章 讨论

4．1 缺血后处理在心肌缺血再灌注损伤中的心肌保护机制

4．2 细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤的作用

4．3 Notch 1信号通过抗凋亡途径在心肌缺血后处理心肌保护的探讨

4．4 本课题研究的局限性

4．5 展望

第5章 结论

致谢

参考文献

附图

攻读学位期间的研究成果

综述 心肌缺血后处理研究进展