不同糖环境对FGL2基因沉默后的大鼠心肌微血管内皮细胞全基因表达谱的影响

摘要

目的：心肌微血管内皮细胞(Myocardial microvascular endothelial cells，MMVECs)是微血管的基本结构，也是心脏重要的内分泌器官。许多心血管系统疾病的致病因子以心肌微血管内皮细胞作为靶器官;而心肌微血管内皮细胞的结构和功能障碍又是许多心血管疾病的起病原因。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DC)是糖尿病的常见慢性并发症，目前其发病机制尚未完全明确，高糖导致内皮细胞功能紊乱的机制尚不完全清楚。有研究表明，高血糖对微血管内皮细胞的损伤可能是DC时心肌细胞损伤的促发因素。纤维蛋白原样蛋白2(Fibrinogen-like protein2，Fgl2)凝血酶原酶又称纤维介素，是近年来热点研究的凝血因子，涉及多种疾病的病理生理过程。本研究旨在通过高通量表达谱芯片技术，观察不同葡萄糖浓度培养对Fgl2基因沉默的大鼠心肌微血管内皮细胞全基因表达谱的影响，从分子水平探讨糖环境和Fgl2基因对微血管内皮细胞功能影响可能的基因和分子机制，为糖尿病心肌微血管病变的治疗提供新的靶点和思路。
　　方法：⑴原代大鼠心肌微血管内皮细胞的提取、培养和鉴定:取一周龄健康清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠，无菌条件下取出心脏，酶消化法培养原代MMVECs。待原代细胞单层融合后消化传代，取第二代细胞经免疫荧光法鉴定MMVECs特征性表面抗原CD31-RA和F(VIII)-RA。⑵按基因沉默设计原则构建fgl2shRNA慢病毒表达载体和空载阴性对照，并转染MMVECs，免疫荧光鉴定是否转染成功。⑶通过Ensembl数据库查询RGSC3.4版大鼠表达谱基因信息，应用无膜芯片合成技术合成大鼠12×135K Array表达谱芯片，每个芯片含有26419个基因。单个基因在每张芯片上设计了3个以上的探针，提高检测的准确性。⑷实验分组:取培养的第三代MMVECs，分为高糖培养和正糖培养两大组。各包含三个亚组：单纯培养组（空白对照组）；空载体转染组(GFP组)；fgl2RNAi慢病毒转染组（fgl2shRNA慢病毒转染组）。⑸稳定转染72小时后，提取RNA，检测RNA质量;cDNA合成和标记;将标记好的探针和表达谱芯片杂交;图像采集和数据分析。
　　结果：①分离培养原代大鼠心肌微血管内皮细胞成功，纯度达95％以上，细胞形态表现出典型的“铺路石样”形态。②经免疫荧光法检测，细胞CD31、F(VIII)阳性率达90％以上。CD31主要呈红色荧光分布在细胞膜中;F(VIII)主要呈绿色荧光分布在胞浆中。③经酶切及DNA测序检测fgl2shRNA慢病毒表达载体构建成功。经fgl2shRNA慢病毒转染36h后，90％以上的MMVECs可观察到绿色荧光蛋白显影，证明病毒已经成功转染入细胞内。④表达谱芯片结果表明，高糖组和正糖组组内对比全基因表达谱有明显差异，病毒转染组在高糖、正糖组间也有明显差异。根据实验分组对比，筛选出部分单纯Fgl2基因沉默和单纯糖环境引起的表达显著差异基因。结果具有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论：成功培养大鼠原代心肌微血管内皮细胞;fgl2shRNA慢病毒载体构建成功;成功用fgl2shRNA慢病毒转染MMVECs;高糖组、正糖组各组内MMVECs全基因表达谱有明显差异，证明Fgl2基因通过RNA干扰影响多个MMVECs基因的表达;fgl2shRNA慢病毒转然后在不同糖环境下培养，MMVECs全基因表达谱有明显差异，证明不同糖环境下生长的细胞其基因表达谱是有改变的。Fgl2基因通过RNA干扰对大鼠心肌微血管内皮细胞的Smoc1、Scn7a、Epyc、Mal2、Hils1、Gcnt2、St6gal1、Alk、Ccl3等基因有特别显著地影响。糖环境对MMVECs的影响特别明显的表现在LOC499607、Acyp2-ps1、RGD1566264这三个基因上。筛选出的这些表达差异最显著的基因，为后续研究指出了方向。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 实验器材的准备

2．2．2 相关实验液体的配制

2．2．3 对心肌微血管内皮细胞进行培养和鉴定

2．2．4 Fg122shRNA慢病毒载体的构建

2．2．5 实验分组

2．2．6 慢病毒转染大鼠MMVECs

2．2．7 细胞总RNA提取和质量控制

2．2．8 cDNA的合成

2．2．9 Klenow Fragment标记cDNA

2．2．10 全基因表达谱芯片检测

2．3 统计学分析

第3章 实验结果

3．1 大鼠心肌微血管内皮细胞培养结果观察

3．2 大鼠原代心肌微血管内皮细胞的鉴定结果

3．3 Fg12shRNA慢病毒载体的鉴定

3．4 慢病毒转染MMVECs效果观察

3．5 RNA质量检测结果

3．5．1 NanoDropTM ND-1000紫外分光光度计测定细胞总RNA的OD值

3．5．2 NanoDropTM ND-1000紫外分光光度计测定ds-cDNA的OD值

3．5．3 NanoDropTM ND-1000紫外分光光度计测定labeled DNA的OD值

3．5．4 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性

3．6 表达谱基因芯片的数据分析

3．6．1 数据信息标准化处理和低强度信号过滤后基因数据的质量评估

3．6．2 基因芯片杂交信号散点图

3．6．3 差异表达基因的筛选

3．6．4 样本分层聚类分析图

3．6．5 显著差异表达基因的筛选

第4章 讨论

4．1 大鼠心肌微血管内皮细胞的培养与鉴定

4．2 表达谱芯片的结果分析

第5章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

致谢

参考文献

综述 微血管内皮细胞功能的概述