Hp通过Akt信号通路诱导胃粘膜细胞发生上皮间质转化(EMT)的研究

摘要

背景：胃癌是全球第四大最常见的恶性肿瘤，也是我国第二大常见，是癌症相关死亡的主要疾病因素。尽管近年来在胃癌的预防、早期诊断和治疗方面取得了长足的进展，全球胃癌的发病率和死亡率均有所降低，但在我国胃癌的发病率和死亡率仍居高不下，每年约有17万人死于胃癌，占所有癌症死亡人数的1/5。目前普遍认为，Hp是慢性胃炎的病原菌，在消化性溃疡的发生和复发中可能起重要作用。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺杆菌定为Ⅰ类致癌原。EMT是指在胚胎发育、肿瘤转移或组织纤维化过程中发生的上皮细胞脱黏附而转变成具迁移能力的间质细胞的现象，在细胞凋亡与增值、迁移与粘附中发挥重要作用。研究证实，Hp可通过激活胃癌上皮细胞PI3K/Akt信号通路诱导EMT，促进胃癌的侵袭和转移。但Hp感染正常胃粘膜细胞是否诱发EMT国内外未见明确报道。
　　目的：探讨Hp感染正常胃粘膜是否通过PI3K/Akt信号通路诱导胃粘膜发生EMT，从而导致增值、凋亡紊乱参与疾病发生，阐明Hp的致病机制，为Hp感染相关性疾病防治策略的制定提供新的理论和依据。
　　方法：①收集Hp阳性和阴性的慢性非萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生和胃癌病理标本（每组分别为39例、40例、39例和47例，其中再分为Hp阳性和阴性，共165例），行免疫组化检测Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达。②ATCC43504 Hp标准菌株以MOI=50作用GES-1，同时以同体积细胞培养液作用的GES-1作为对照组，0、0.5、1、3、6和12h后，行Western blot检测Akt-GSK-3β-EMT信号通路相关蛋白的表达。③Akt抑制剂Akt InhibitorⅧ10μM预处理GES-11h，同时以同体积DMSO作用和未预处理的GES-1作为对照组，再以ATCC43504 Hp标准菌株MOI=50作用1h，行Western blot检测Akt-GSK-3β-EMT信号通路相关蛋白的表达。④采用四唑蓝(MTT)比色试验检测细胞存活率。
　　结果：⑴Akt蛋白表达水平在各病变阶段间无显著性差异(p＞0.05);将所有标本按Hp阳性和阴性分两组，Hp阳性组和阴性组各病变阶段Akt蛋白表达亦呈现出类似结果(p＞0.05)。p-Akt蛋白表达水平在各病变阶段间无显著性差异(p＞0.05);将所有标本按Hp阳性和阴性分两组，Hp阳性组各病变阶段p-Akt蛋白表达亦呈现出类似结果(p＞0.05)，而Hp阴性组p-Akt蛋白表达水平随胃黏膜病变的演化而升高，在胃癌组达到最高(p＜0.05)。Akt蛋白表达在各病变阶段Hp阳性和阴性组间均无显著性差异(p＞0.05)。p-Akt蛋白表达在肠上皮化生、异型增生和胃癌阶段Hp阳性和阴性组间亦无显著性差异(p＞0.05)，而在慢性非萎缩性胃炎阶段Hp阳性组p-Akt蛋白表达显著高于Hp阴性组(p＜0.05)。⑵GSK-3β蛋白表达水平随胃黏膜病变的演化而升高，但在胃癌组表达反而最低，各病变阶段间表达有显著性差异(p＜0.001);将所有标本按Hp阳性和阴性分两组，Hp阳性组和阴性组各病变阶段GSK-3β蛋白表达亦呈现出类似结果(p＜0.001和p＜0.05)。p-GSK-3β蛋白表达水平在慢性非萎缩性胃炎组最低，后随胃黏膜病变的演化而升高，在胃癌组表达最高(p＜0.05);将所有标本按Hp阳性和阴性分两组，Hp阳性组各病变阶段p-GSK-3β蛋白表达亦呈现出类似结果(p＜0.05)，而Hp阴性组各病变阶段p-GSK-3β蛋白均有较高水平表达，各病变阶段间表达无显著性差异(p＞0.05)。GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表达在慢性非萎缩性胃炎、肠上皮化生和异型增生阶段Hp阳性和阴性组间亦无显著性差异(p＞0.05)。但在胃癌阶段，GSK3β蛋白表达在Hp阳性组显著低于Hp阴性组(p＜0.05)，而p-GSK-3β蛋白表达在Hp阳性组显著高于Hp阴性组(p＜0.05)。⑶E-cadherin蛋白表达水平随胃黏膜病变的演化而降低，在胃癌组表达最低(p＜0.001);将所有标本按Hp阳性和阴性分两组，Hp阳性组和阴性组各病变阶段E-cadherin蛋白表达亦呈现出类似结果(p＜0.001和p＜0.05)。N-cadherin蛋白表达水平在慢性非萎缩性胃炎组最低，后随胃黏膜病变的演化而升高，在胃癌组表达最高，(p＜0.05);将所有标本按Hp阳性和阴性分两组，Hp阳性组各病变阶段N-cadherin蛋白表达亦呈现出类似结果(p＜0.05)，Hp阴性组在异型增生组及胃癌组均有较高水平表达(p＜0.05)。E-cadherin蛋白表达在肠上皮化生和异型增生阶段Hp阳性和阴性组间均无显著性差异(p＞0.05)，而在慢性非萎缩性胃炎和胃癌阶段Hp阳性组E-cadherin蛋白表达显著低于Hp阴性组(p＜0.05)。N-cadherin蛋白表达在慢性非萎缩性胃炎、肠上皮化生和异型增生阶段Hp阳性和阴性组间亦无显著性差异(p＞0.05)，而在胃癌阶段Hp阳性组N-cadherin蛋白表达显著高于Hp阴性组(p＜0.05)。⑷Hp活菌以MOI=50作用GES-1不同时间后，Akt、GSK3β表达水平均无明显变化(p＞0.05)，而p-Akt表达水平在作用后0.5h即升高，3h达到高峰，12h内均高于0h(p＜0.001); p-GSK3β表达水平在作用后0.5h即增加，后逐渐升高，12h达到高峰(p＜0.01); E-Cadherin表达水平在作用后0.5h即减少，后逐渐降低，6h达到低谷，12h内均低于0h(p＜0.05); N-Cadherin表达水平在作用后0.5h即增加，后逐渐升高，3h达到高峰，12h内均高于0h(p＜0.001)。而对照组Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、E-Cadherin、N-Cadherin蛋白表达水平均无明显变化(p＞0.05)。⑸Akt InhibitorⅧ以10μm预处理GES-11h后，p-Akt(p＜0.001)、p-GSK-3β(p＜0.001)表达受抑，而Akt、GSK-3β、E-Cadherin、N-Cadherin表达无明显变化(p＞0.05); DMSO预处理GES-11h后Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、E-Cadherin、N-Cadherin表达则均无明显变化(p＞0.05)。⑹对照组、DMSO组、Akt iⅧ组中Hp作用亚组均以Hp活菌按MOI=50作用1h后，各组间Akt、GSK-3β表达均无明显变化(p＞0.05)。对照组、DMSO组中Hp作用亚组p-Akt(p＜0.05、p＜0.01)、p-GSK-3β(p＜0.01、p＜0.05)、N-Cadherin(p＜0.05、p＜0.05)表达水平均显著高于各自组中的Hp未作用亚组，E-Cadherin(p＞0.05、p＞0.05)表达水平则均低于各自组中的Hip未作用亚组;而Akt iⅧ组中Hp作用亚组p-Akt、p-GSK-3β、N-Cadherin、E-Cadherin表达水平与各自组中的Hp未作用亚组均无明显差异(p＞0.05)。⑺Hp活菌以不同浓度作用GES-1不同时间后MTT显示，Hp活菌按MOI=5、10作用12h内，GES-1细胞存活率均无明显变化(p＞0.05);而按MOI=50、100作用6h后，GES-1细胞存活率均开始升高，12h达高峰(p＜0.001)，作用6、12h细胞存活率显著高于0.5、1、3h(p＜0.001)，作用12h细胞存活率显著高于6h(p＜0.001)。在Hp活菌作用GES-10.5、1、3h后，各浓度组与对照组间细胞存活率均无明显差异(p＞0.05);而在作用6、12h后，MOI=50、100组细胞存活率均显著高于对照组及MOI=5、10组(p＜0.001)，MOI=100组细胞存活率显著高于MOI=50组(p＜0.001)。⑻Hp活菌以MOI=50作用DSMO、Akt iⅧ预处理的GES-1不同时间后MTT显示，在作用无预处理、DSMO预处理的GES-16h后，细胞存活率均开始升高，12h达高峰(p＜0.001)，作用6、12h细胞存活率显著高于0.5、1、3h(p＜0.001)，作用12h细胞存活率显著高于6h(p＜0.01);而在作用Akt iⅧ预处理的GES-112h内，细胞存活率则无明显变化(p＞0.05);在Hp活菌作用无预处理、DSMO预处理的GES-10.5、1、3h后，各组细胞存活率与各自对照组间均无明显差异(p＞0.05)，作用6、12h后，各组细胞存活率均显著高于各自对照组细胞存活率(p＜0.001);而Hp活茵作用Akt iⅧ预处理的GES-112h内，细胞存活率与对照组间则均无明显差异(p＞0.05)。在Hp活菌作用无预处理、DSMO、Akt iⅧ预处理的GES-10.5、1、3h后，各组间细胞存活率无明显差异(p＞0.05);作用6、12h后，无预处理、DSMO预处理的GES-1细胞存活率均显著高于Akt iⅧ预处理的GES-1细胞存活率(p＜0.001)，而无预处理、DSMO预处理的GES-1间细胞存活率无明显差异(p＞0.05)。
　　结论：①体内研究结果说明:Akt-GSK-3β-EMT信号通路参与了Hp感染相关胃粘膜病变发生、发展，并且可能在胃粘膜早期病变阶段启动了EMT，促进胃癌的发生。②体外研究结果:Hp感染的早期即可通过激活Akt信号通路并作用其下游因子GSK-3β而诱导正常胃粘膜细胞发生EMT，进而引起胃黏膜细胞增殖、凋亡紊乱，参与胃癌的发生。③在Hp感染时阻断Akt通路可阻断EMT的发生，提示Hp诱导正常胃粘膜上皮细胞发生EMT依赖于Akt的活化。④Hp感染可通过Akt-GSK-3β-EMT信号通路诱导正常胃粘膜上皮细胞存活率升高。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

第1章 引言

第2章 人胃粘膜癌变过程中Akt-GSK-3β-EMT信号通路的变化及其与Hp感染的关系

2．1 实验材料和方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 实验结果

2．2．1 病理标本总体情况

2．2．2 Hp阳性组和阴性组Akt-GSK-3β-EMT通路相关蛋白在不同胃黏膜病变中的表达

2．2．3 不同胃粘膜病变中Akt-GSK-3β-EMT通路相关蛋白在Hp阳性和阴性组间的表达差异

2．3 讨论

第3章 Hp活菌对胃黏膜上皮细胞株Akt-GSK-3β-EMT信号通路的影响

3．1 材料和方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

第4章 Akt在Hp活菌激活胃粘膜上皮细胞株发生Akt-GSK-3β-EMT中的作用

4．1 材料和方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验方法

4．2 实验结果

4．2．1 Akt抑制剂Akt InhibitorⅧ最佳预处理条件的确定

4．2．2 Akt InhibitorⅧ对Hp活菌激活胃黏膜上皮细胞株Akt-GSK-3β-EMT信号通路的影响

4．3 讨论

第5章 Akt-GSK-3β-EMT信号通路在Hp活菌对胃粘膜上皮细胞株生物学行为影响中的作用

5．1 材料和方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验方法

5．2 实验结果

5．2．1 Hp活菌对胃黏膜上皮细胞株细胞生存率的影响

5．2．2 Akt在Hp活菌对胃黏膜上皮细胞株细胞生存率影响中的作用

5．3 讨论

第6章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述 上皮间质转化与胃癌的研究进展