池蝶蚌脂多糖诱导的肿瘤坏死因子LITAF基因的克隆及对Hela细胞的凋亡效应

摘要

脂多糖诱导的肿瘤坏死因子(Lipopolysaccharide-induced TNF-α factor, LITAF)是一类新发现的重要的转录因子,该因子介导 TNF-α和各种炎症因子的表达,在先天性免疫中扮演着重要的角色。目前,我们克隆了池蝶蚌LITAF基因的的 cDNA序列(定义为 HsLITAF)。结果显示该 cDNA序列包含453个核苷酸的开放阅读框,编码150个氨基酸,同已知物种的 LITAF序列具有34％-73.3%的氨基酸同源性。该推导的 HsLITAF多肽分子质量为16.08KDa,等电点为8.04。序列比对发现 HsLITAF在 C-末端有完整的LITAF功能域,包含两个 CXXC模式域且该结构形成 Zn2+指结构。
　　进一步分析发现扩增该段基因的上下游引物是相同的,且在池蝶蚌闭壳肌、斧足、性腺、肝胰腺、鳃、外套膜和血淋巴等组织中都检测到除上述之外的另外一种形式,两种形式分别命名为 LITAF1和 LITAF2,且两种形式的 cDNA序列在数量上只相差24个碱基和9个氨基酸。用该引物检测基因组,未发现内含子。
　　荧光定量结果显示 HsLITAF在鳃中表达量最高,在肝胰腺,血淋巴,闭壳肌和性腺中表达量适中,而在心脏和外套膜中表达量最低。在 LPS刺激后,血淋巴 HsLITAF表达量在6 h、24 h和48 h降低,但是在刺激72 h后,其表达量显著性地上调且为对照组的39倍。推测池蝶蚌 LITAF参与了先天性免疫反应。
　　为了进一步研究 HsLITAF的生物学功能,我们构建了 pcDNA3.1(+)-HsLITAF表达载体,并转染进 Hela细胞。流式细胞仪及 RT-PCR分析显示实验组 Hela细胞发生更高的凋亡率,并显著上调凋亡基因 p53及 Bax的表达,是对照组的2.99倍和2.53倍。据此,我们推测线粒体可能参与了 LITAF诱导的凋亡。该研究为了解 HsLITAF的功能及诱导凋亡的信号通路提供了新视角。

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第一章 前言

LITAF 的发现

LITAF 的信号通路研究进展

LITAF 与相关医学研究

LITAF 在水生动物的研究

本论文研究的目的和意义

第二章 材料和方法

2.1 仪器与试剂

2.1.1 主要仪器设备

2.1.2 主要试剂与试剂盒

2.1.3 载体与菌种

2.2 实验材料

2.3 相关软件

2.4 实验方法

2.4.1 池蝶蚌 LITAF 基因的克隆

2.4.2 池蝶蚌 LITAF 开放阅读框序列在基因组上的结构

2.4.3 细胞培养

2.4.4 实时荧光定量 PCR 分析

2.4.5 池蝶蚌 LITAF 基因的凋亡功能分析

第三章 实验结果

3.1 池蝶蚌总 RNA 的提取

3.2 LITAF cDNA 的完整的 ORF 序列及推导的氨基酸序列

3.3 池蝶蚌 LITAF ORF 框序列的基因组序列

3.4 池蝶蚌 LITAF 基因的定量表达

3.4.1 池蝶蚌 LITAF 基因的组织表达

3.4.2 LPS 和 PBS 刺激后 LITAF 在血淋巴中的表达变化

3.5 流式细胞仪检测 HsLITAF 诱导的细胞凋亡变化

3.6 荧光定量检测 Hela 细胞凋亡相关基因的表达

第四章 讨论

致谢

参考文献

附录：中英文翻译对照

攻读学位期间的研究成果