重组人红细胞生成素对高糖环境下体外培养HK-2细胞RhoA/ROCK信号通路的影响

摘要

目的:
　　探讨重组人红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)对高糖环境下体外培养正常人肾小管上皮细胞(human kidney proximal tubular epithelial cell-2,HK-2细胞) RhoA/ROCK信号通路的影响,为糖尿病肾病( diabetic nephropathy,DN)患者药物治疗寻找新的途径。
　　方法:
　　将体外培养的HK-2细胞按随机数字表法分为空白对照组、高糖诱导组(D-葡萄糖终浓度30mmol/l)、渗透压对照组(甘露醇终浓度24.5mmol/l)、rhEPO对照组(rhEPO终浓度为20 U/ml)、不同浓度rhEPO组(rhEPO终浓度分别为5、10、20 U/ml)及Rho激酶抑制剂(Y27632)组(Y27632终浓度为10μmol/l,加入Y2763230 min后加D-葡萄糖,D-葡萄糖终浓度为30 mmol/l),各实验组均给予诱导时间为24 h。光学显微镜下观察各实验组HK-2细胞形态学的变化。RT-PCR法检测各实验组HK-2细胞中RhoAmRNA、ROCK1mRNA的表达水平;细胞免疫荧光法检测各实验组HK-2细胞E-钙黏蛋白(epithelial- cadherin, E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达情况;ELISA法检测各实验组HK-2细胞培养上清液中纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等蛋白的表达。流式细胞术检测各实验组HK-2细胞凋亡的变化。
　　结果:
　　光学显微镜下观察HK-2细胞形态的变化,正常HK-2为椭圆形或梭形,呈“鹅卵石”或“铺路石”样排列,给予高糖刺激后细胞胞体逐渐变长,细胞间隙逐渐变大,但给予不同浓度rhEPO或Y27632后,其形态学明显改善。RT-PCR结果显示高糖诱导组RhoAmRNA及ROCK1mRNA表达较空白对照组显著升高(P<0.05),但分别给予不同浓度rhEPO干预后,RhoAmRNA及ROCK1mRNA的表达显著减少(P<0.05)。给予Y27632抑制后,RhoAmRNA的表达较高糖诱导组无显著性差异(P>0.05),而 ROCK1mRNA的表达则明显减少(P<0.05)。ELISA及细胞免疫荧光结果显示高糖诱导组FN蛋白、α-SMA蛋白的表达较空白对照组明显增加(P<0.05),但分别加入不同浓度rhEPO干预或Y27632抑制后,FN蛋白、α-SMA蛋白的表达明显减少(P<0.05)。高糖组 E-cadherin蛋白表达较空白对照组明显减少,分别给予不同浓度rhEPO干预或Y27632抑制后, E-cadherin蛋白表达明显增加(P<0.05),在实验用rhEPO浓度范围内,蛋白的表达呈现出与 rhEPO浓度的相关性。ELISA结果显示高糖诱导组 IL-6蛋白、TNF-α蛋白表达较空白对照组明显增多(P<0.05),但分别给予不同浓度rhEPO干预或Y27632抑制后,IL-6蛋白、TNF-α蛋白表达明显减少(P<0.05),并且在实验用rhEPO浓度范围内,呈现出rhEPO浓度的依赖性。流式细胞检测结果显示高糖可诱导HK-2凋亡,但给予不同浓度rhEPO干预或Y27632抑制后,HK-2细胞早期凋亡率及晚期凋亡加死亡细胞比率明显下降(P<0.05)。Person直线相关分析提示高糖诱导组及不同浓度rhEPO组RhoAmRNA与ROCK1mRNA的表达呈正相关。
　　结论:
　　1、高糖能通过增加体外培养的 HK-2细胞中 RhoAmRNA、ROCK1mRNA的表达水平,使细胞 E-cadherin蛋白表达减少,α-SMA蛋白表达增多,诱导正常HK-2细胞发生间充质转分化(epithelial to mesenchymal transition,EMT),引起细胞外基质成分FN蛋白表达增加,在实验用rhEPO浓度范围内,rhEPO可呈浓度依赖性抑制高糖诱导的 HK-2细胞转分化过程,延缓肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)的进展。
　　2、在实验用rhEPO浓度范围内,rhEPO可呈浓度依赖性地抑制HK-2细胞凋亡从而发挥其肾脏保护作用。
　　3、rhEPO可以通过减少炎症因子的产生,减轻炎性反应,从而延缓DN的进展。
　　4、rhEPO对高糖环境下体外培养的 HK-2细胞的保护作用可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。

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缩略词索引表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法与步骤

2.3 统计学方法

第3章 结果

3.1 HK-2细胞形态学观察

3.2 高糖、rhEPO对HK-2细胞中RhoAmRNA、ROCK1mRNA表达的影响

3.3高糖、rhEPO、Y27632对HK-2细胞α-SMA、E -cadherin及FN蛋白表达影响

3.4 高糖、rhEPO、Y27632对IL-6、TNF-α蛋白表达的影响

3.5 高糖、rhEPO、Y27632对HK-2细胞凋亡的影响

3.6 相关分析

第4章 讨论

4.1 HK-2细胞转分化与DN

4.2 rhEPO对高糖环境下HK-2细胞EMT过程的抑制作用

4.3 RhoA/ROCK信号通路在rhEPO抑制EMT过程中的作用

4.4 rhEPO对高糖诱导HK-2细胞EMT过程中炎症因子的影响

4.5 rhEPO对高糖诱导HK-2细胞凋亡的作用

第5章 结论和展望

5.1 结论

5.2 不足与展望

致谢

参考文献

附图

攻读学位期间的研究成果

综述