Nrf2-Keap1-ARE信号通路在自噬调控酒精诱导肝星状细胞增殖活化中的作用及相关机制研究

摘要

目的：研究自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对酒精诱导下肝星状细胞增殖活化的影响,并探讨Nrf2-Keap1-ARE信号通路在自噬调控酒精诱导的肝星状细胞活化中的地位,为抗酒精性肝纤维化提供新的研究思路及药物研发靶点。
　　方法：该研究以含酒精的培养基处理大鼠肝星状细胞系HSC-T6以建立体外酒精诱导肝星状细胞活化模型;将自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤处理HSC-T6细胞,观察自噬水平下降对肝星状细胞活化水平及Nrf2-keap1-ARE信号通路活化程度的影响;采用脂质体瞬时转染法将构建的pEGFP-Nrf2重组质粒或合成的siNrf2片段转染入HSC-T6细胞中,从而过上调或下调细胞内Nrf2表达水平,一方面探讨Nrf2过表达对酒精刺激下肝星状细胞活化水平的影响,另一方面通过沉默Nrf2表达以探讨Nrf2在自噬调控肝星状细胞活化机制中的地位;分别采用RT-PCR及Western blotting对HSC-T6细胞活化标志蛋白α-SMA及I-collagen mRNA及蛋白表达水平进行检测以判断HSC-T6细胞活化水平;采用MDC染色、自噬标志蛋白LC3II及自噬特异底物P62蛋白表达检测以判断细胞自噬水平;采用MTT法及流式细胞术分别对HSC-T6细胞增殖水平以及细胞周期分布进行检测。
　　结果：酒精作用下HSC-T6细胞活化水平增高,伴有细胞内自噬水平升高;3-甲基腺嘌呤作用于HSC-T6细胞后,自噬水平明显下降且伴有细胞活化水平下降;3-甲基腺嘌呤作用于HSC-T6细胞可导致细胞内Nrf2活化水平升高;上调Nrf2表达可发挥抗酒精诱导的HSC-T6细胞增殖活化作用,而采用RNA干扰技术抑制Nrf2表达可部分抵消3-甲基腺嘌呤对酒精刺激下HSC-T6增殖活化的抑制作用。
　　结论：自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤具有抗酒精诱导的肝星状细胞增殖活化效应,而自噬水平下降引起的Nrf2活化在这一调控过程中发挥着重要作用。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

中英缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 细胞株

2.1.2 重组质粒及RNA干扰片段

2.1.3 主要材料及试剂

2.1.4 主要仪器设备1.

2.1.5 试剂的配置

2.2 方法

2.2.1 细胞培养、复苏、传代及冻存

2.2.2 大鼠酒精性肝纤维化肝星状细胞模型的建立

2.2.3 质粒提取：

2.2.4 质粒瞬时转染：

2.2.5 RNA干扰片段筛选及转染

2.2.6 RNA抽提

2.2.7 逆转录

2.2.8 RT-PCR检测Nrf2、α-SMA、I-collagen、β-actin的mRNA表达

2.2.10 MTT（四甲基偶氮唑盐）检测细胞增殖水平

2.2.11 流式细胞术检测细胞周期分布

2.2.12 MDC染色法检测细胞自噬水平

2.2.13 统计学分析：

第3章 结果

3.1 自噬抑制剂3-MA对酒精刺激下肝星状细胞增殖活化的影响

3.2 自噬抑制剂3-MA对肝星状细胞中Nrf2核转位及活化的影响

3.3 Nrf2过表达对酒精刺激下肝星状细胞增殖活化的影响

3.4 Nrf2在自噬调控酒精诱导的肝星状细胞活化中的作用

第4章 讨论

4.1 国内外研究现状

4.2 肝星状细胞活化在酒精性肝纤维化发病机制中的重要作用

4.3 酒精所致氧化应激是激活HSCs的重要因素

4.4 Nrf2-keap1-ARE信号通路在酒精致肝内氧化应激中的调控作用

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 研究中的不足以及进一步的工作方向

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述