杜仲叶提取物及其单体槲皮素、（+）-丁香脂素抑制BMSCs成脂分化研究

摘要

目的：
　　研究杜仲叶提取物抑制 BMSCs成脂分化作用及其有效物质的筛选。
　　方法：
　　取 SD大鼠(一个月龄左右)1只,通过全骨髓贴壁法分离 SD大鼠 BMSCs;用流式细胞学方法进行 BMSCs鉴定;分别用苔盼蓝计数法及 MTT法对细胞生长曲线进行测定;配制脂肪细胞分化诱导液,初步对杜仲叶提取物及其单体化合物进行研究,实验分4组:药物(1μg/ml)+阳性组、药物(0.01μg/ml)+阳性组、阳性组、阴性组;对有效物质进行下一步实验,实验分5组:药物(1μg/ml)+阳性组、药物(0.1μg/ml)+阳性组、药物(0.01μg/ml)+阳性组、阳性组、阴性组;干预14天后终止培养,观察各组细胞形态学改变,并用油红 O染色法进行细胞染色、并计数;用荧光定量 PCR法分别检测脂肪细胞分化关键基因 PPARγ2及 C/EBPα表达水平。
　　结果：
　　流式细胞仪检测结果显示 CD29、CD90阳性率分别为93.86％、92.16%, CD34、CD45阳性率分别为6.99%、5.31%;苔盼蓝法对第3、4、5代 BMSCs进行计数,发现不同代数细胞生长趋势相仿,继续用 MTT法检验第3代细胞生长情况,结果与苔盼蓝计数一致;油红 O染色及计数成脂率结果示,与阳性组比较,杜仲叶提取物、槲皮素、(+)-丁香脂素各干预组脂肪细胞分化率均减少(p<0.05),且具有药物浓度依赖性;荧光定量 PCR法检测基因结果显示:与阳性组相比,杜仲叶提取物、槲皮素、(+)-丁香脂素各药物干预组的 PPARγ2及C/EBPα表达水平下调均具有显著差异(p<0.05),且具有浓度依赖性。
　　结论：
　　杜仲叶提取物及其化合物槲皮素、(+)-丁香脂素均具有抑制 BMSCs成脂分化的作用,且具有浓度依赖性,其机制与 PPARγ2及 C/EBPαmRNA表达水平的下调有关。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第 1 章 前言

第 2 章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 实验材料准备

2.2.2 SD 大鼠 BMSCs 的分离、培养

2.2.3 SD 大鼠 BMSCs 形态学观察及鉴定

2.2.4 细胞生长曲线测定

2.2.5 SD 大鼠 BMSCs 成脂分化诱导液配制

2.2.6 药物稀释及实验分组

2.2.7 油红 O 染色并计数

2.2.8 real-time PCR 检测 PPARγ2、C/EBPα表达水平

2.3 统计学处理

第 3 章 结果

3.1 观察细胞形态

3.2 SD 大鼠 BMSCs 表面抗原标记的鉴定

3.3 苔盼蓝计数及 MTT 测定细胞生长情况

3.4 成脂诱导后细胞形态观察

3.5 油红 O 染色并计数

3.5.1 初筛药物干预后染色并计数

3.5.2 活性药物干预后染色并计数

3.6 real-time PCR 检测结果

3.6.1 目的基因及内参扩增曲线和溶解曲线

3.6.2 荧光定量 PCR 相对表达水平

第 4 章 讨论

4.1 大鼠 BMSCs 培养实验研究

4.1.1 细胞分离、培养、生长曲线

4.1.2 细胞鉴定

4.2 杜仲对 SD 大鼠 BMSC 抑制成脂分化有效成分筛选

4.2.1 成脂分化关键因子

4.2.2 活性成分筛选的研究

第 5 章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间的研究成果

综 述