缺氧预适应通过Nrf2通路上调抗氧化酶介导心肌细胞延迟保护的实验研究

摘要

目的:
　　构建靶向Nrf2基因的siRNA真核表达重组载体,转染H9c2心肌样细胞,利用缺氧/复氧(H/R)损伤模型及缺氧预适应(HPC)延迟保护模型,从Nrf2-ARE信号通路的角度,探讨 HPC上调抗氧化酶(HO-1、MnSOD)介导心肌细胞延迟保护的新途径。
　　方法:
　　1.利用siRNA真核表达载体pGPU6/GFP/Neo,设计并构建靶向Nrf2的RNA干扰重组质粒pGPU6/GFP/Neo-Nrf2 siRNA,同时设计并构建阴性对照RNA干扰重组载体,用于鉴定pGPU6/GFP/Neo质粒介导的RNA干扰体系的特异性;
　　2.通过Western Blot法分别检测H9c2心肌样细胞经HPC处理后0、12、24、48、72 h各时间点的Nrf2核转位变化;并在Nrf2核转位最显著的时间点,应用染色质免疫共沉淀(ChIP)法检测胞核内Nrf2与HO-1及MnSOD基因启动子区内抗氧化反应元件(ARE)结合的变化;
　　3. H9c2细胞经 pGPU6/GFP/Neo-Nrf2 siRNA重组载体或阴性对照载体pGPU6/GFP/Neo-NC siRNA瞬时转染24 h后,建立HPC延迟保护模型。实验处理后,通过Western Blot法分别检测核内Nrf2蛋白表达以及胞内HO-1、MnSOD蛋白表达的变化;
　　4. H9c2细胞经 pGPU6/GFP/Neo-Nrf2 siRNA重组载体或阴性对照载体pGPU6/GFP/Neo-NC siRNA瞬时转染24 h后,分别建立H/R损伤及HPC延迟保护模型。实验处理后,MTT法检测各实验组心肌细胞存活率;根据试剂盒说明分别检测各组细胞内LDH的漏出量,应用比色法测定MDA含量以及SOD、CAT、GPx等抗氧化物酶的活性;流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)含量的变化。
　　结果:
　　1.经基因测序证实,成功构建了 Nrf2 siRNA真核表达重组质粒pGPU6/GFP/Neo-Nrf2 siRNA及阴性对照载体pGPU6/GFP/Neo-NC siRNA。此外,经Western blot检测证实该质粒瞬时转染H9c2细胞24 h后,胞内Nrf2蛋白表达显著下调。
　　2. H9c2心肌样细胞经HPC处理后12 h,Nrf2核转位开始增加,HPC后24 h达到峰值,而HPC后72 h回到基础水平。可见,HPC诱导Nrf2核转位变化与HPC延迟保护出现的时间窗相一致;同时,ChIP法证实HPC后24 h,Nrf2在胞核内与HO-1及MnSOD基因启动子区内ARE的结合均明显增加。
　　3. H9c2心肌样细胞经HPC处理后24 h,核内Nrf2蛋白表达及胞内抗氧化酶HO-1、MnSOD的蛋白表达水平显著增加,与相应的Control组比较均有显著性差异(p<0.01)。然而,预先瞬时转染Nrf2 siRNA表达载体后,HPC上述效应被逆转。
　　4. H9c2心肌样细胞经HPC处理后24 h,可显著提高H/R损伤心肌细胞的生存率,抑制LDH的活性;并能显著减少H9c2心肌细胞H/R过程中所产生的活性氧,同时增加内源性抗氧化酶(SOD,GPx,CAT)活性,并减少MDA的生成,在细胞水平上进一步证明了HPC能对抗H/R所诱发的氧化应激,产生延迟保护作用。然而,预先瞬时转染Nrf2 siRNA表达载体后,HPC上述效应均被逆转。
　　结论:
　　1.成功构建了Nrf2 siRNA真核表达重组质粒pGPU6/GFP/Neo-Nrf2 siRNA,为进一步研究Nrf2信号通路在HPC心肌延迟保护中的作用奠定了基础。
　　2 HPC可以通过激活Nrf2-ARE信号通路,上调抗氧化酶MnSOD及HO-1蛋白表达,对抗H/R引起的氧化应激损伤,发挥心肌延迟保护作用。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

英文缩写及全称和中文对照

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 实验主要材料

2.1.1 细胞株、质粒来源

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要实验用液的配置

2.1.4实验主要仪器和设备

2.2 实验方法与步骤

2.2.1 H9c2细胞的复苏、培养、传代与冻存

2.2.2 构建靶向Nrf2基因的siRNA表达载体

2.2.3 基因转导技术

2.2.4 实验模型的建立

2.2.5 ChIP技术

2.2.6 实验设计与分组

2.2.7 观察指标与方法

2.3 数据处理

第3章 结果

3.1 重组质粒pGPU6/GFP/Neo-Nrf2 siRNA与pGPU6/GFP/Neo-NC siRNA的测序鉴定

3.2 HPC对H9c2细胞内Nrf2-ARE信号通路的影响

3.3 Nrf2-ARE信号通路对HPC上调抗氧化酶蛋白表达的影响

3.4 Nrf2-ARE信号通路对HPC发挥延迟保护作用的影响

3.5 Nrf2-ARE信号通路对HPC延迟相抗氧化应激效应的影响

第4章 讨论

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述