小扁豆植物化学物组成及其抗氧化、抗炎活性研究

摘要

水果、蔬菜和豆类等食物中的植物化学物具有抗炎、抗氧化应激、免疫调节、降低胆固醇和抗癌等功效。小扁豆（ lentil）含有丰富的大量营养素（ macronutrients）、微量营养素（ micronutrients）以及植物化学（phytochemicals）成分。流行病学以及干预治疗研究结果表明定期食用包括小扁豆在内的豆制品与几种慢性病如冠心病、二型糖尿病、心血管疾病、癌症和衰老的发病率呈负相关。小扁豆中富含的植物化学物如类胡萝卜素、生育酚和酚类等活性物质是天然的抗氧化剂，被认为在保持人体健康和预防慢性疾病方面发挥着重要的作用，因此现有的研究都强烈推荐将小扁豆引入日常的膳食结构中。然而目前对小扁豆中富含的植物化学物组成，体外化学和细胞抗氧化、抗炎活性方面的研究还很少，对于烹煮加工过程以及食用后体内消化过程对植物化学物组成和抗炎、抗氧化活性的影响也未见相关报道。
　　为深入了解小扁豆的营养价值，本研究从小扁豆中分别提取脂溶性、水溶性的可提取酚类（Extractable phenolics）和不溶性酚类（Bound phenolics）植物化学物，采用气相色谱（GC）液相色谱（HPLC）和液质联用（LC-MS）定性、定量分析其植物化学物组成。利用96孔板快速检测方法测定其体外化学抗氧化活性。同时，采用更接近人体肠道细胞的 Caco-2细胞建立细胞抗氧化实验模型，更加真实地评估植物化学物在体内的抗氧化活性。还通过模拟家庭的烹煮过程，研究烹煮过程对小扁豆植物化学物组成和抗氧化活性的影响，探讨体外模拟煮熟后小扁豆的胃肠消化过程中，生物活性植物化学物在人体肠道内的生物可接受率。最后建立氧化应激和炎症细胞模型，研究小扁豆中主要植物化学物的抗氧化应激和抗炎活性。具体研究结果如下：
　　1．定性、定量分析小扁豆脂溶性提取物中的脂肪酸、类胡萝卜素和生育酚的组成。脂肪酸组成主要为ω-6亚油酸18:2n-6（40.73-47.06％）、油酸18:1(20.11-28.00%)和棕榈酸16:0(12.67-14.82%)，以及ω-3亚麻酸18:3n-3(9.00-13.28%)。不同品种的小扁豆之间总类胡萝卜素含量（TCC）、总类胡萝卜素指数（TCI）和生育酚含量都具有显著性差异。小扁豆含有的类胡萝卜素主要是叶黄素和玉米黄质素。二十种小扁豆的TCC为5.32~28.13μg/g DW，而TCI为4.64-19.63μg/g DW。小扁豆主要含γ-生育酚，含量为36.32-63.54μg/g DW，其次是α-生育酚（0.16-0.90μg/g DW）和δ-生育酚（0.33-1.25μg/g DW）。绿小扁豆 Greenland的γ-生育酚含量最高，红小扁豆 Impact的 TCC和TCI最高。
　　2．采用快速、准确的96微孔板方法测定20种不同小扁豆品种脂溶性提取物的体外抗氧化活性。DPPH抗氧化活性为3.61-4.48μmol TE/g DW，其中Imvincible的抗氧化活性最高，其次是 Impact和Greenland。PCL法测定的抗氧化活性值为2.73-6.23μmol TE/g DW，其中 Impact抗氧化活性最高，其次是Imperial和 Redcliff。20种小扁豆脂溶性提取物的 DPPH和 PCL抗氧化活性与总类胡萝卜素含量和生育酚含量呈显著正相关。小扁豆中的类胡萝卜素和生育酚在清除 DPPH自由基时可能存在协同效应。类胡萝卜素（主要是叶黄素）在PCL抗氧化活性中贡献最大。
　　3．96孔板法一次性快速、准确地测定20种小扁豆品种的总酚（TPC）、总黄酮（TFC）和缩合单宁（CTC）含量。不同品种小扁豆 TPC为4.56-8.34 mg GAE/g DW； TFC和CTC分别为0.60-1.98 mg CE/g DW和3.00-7.80 mg CE/g DW。其中 Asterix的 TPC、TFC和 CTC含量都是最高，其次为 Greenland和Redcliff。HPLC和 HPLC-MS定性、定量分析二十种小扁豆可溶性酚类提取物中的主要酚类化合物组成，发现最主要的黄酮醇类化合物是山萘酚四糖苷（tetraglycoside）和三糖苷（triglycoside），含量分别为210.05-297.15μg/g DW和99.96-151.81μg/g DW，其次为黄烷醇类化合物儿茶素葡萄糖苷（ catechin glucoside）、表儿茶素葡萄糖苷（ epicatechin glucoside）和儿茶素没食子酸酯（catechin gallate），含量分别为99.27-130.10、44.92-83.55和42.87-73.93μg/g DW。
　　4．96孔板法一次性快速、准确地测定20种小扁豆可溶性酚类提取物的体外化学抗氧化活性。不同品种小扁豆的 DPPH抗氧化活性为23.83-35.03μmol TE/g DW，FRAP测定的样品总还原能力为18.75-34.52 AAE/g DW，ORAC测定的抗氧化活性为105.06-168.03μmol TE/g DW。其中Asterix的抗氧化活性都是最强。在 DPPH、FRAP和 ORAC三种体外化学抗氧化体系中，提取物的抗氧化能力与其酚类含量都呈显著正相关，总酚含量越高，其 DPPH、FRAP和ORAC活性也越高。特别是 FRAP值与总酚指数（TPI）、总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）和缩合单宁含量（CTC）之间的相关性系数最强。
　　5．采用更加敏感的荧光底物4-甲基伞形酮-α-D-葡萄糖苷(4-MUG)和4-甲基伞形酮油酸酯（4-MUO），建立α-葡萄糖苷酶和脂肪酶活性抑制试验的96孔板测定方法。20种不同品种小扁豆可溶性酚类提取物抑制α-葡萄糖苷酶的 IC50为23.08~42.15 mg/mL，抑制脂肪酶的IC50为6.26~9.26 mg/mL，其中Asterix对两种酶的抑制活性都是最强。小扁豆可溶性酚类提取物对α-葡萄糖苷酶和脂肪酶的抑制活性与各种酚类化合物的含量呈显著正相关（p<0.05）；黄酮醇类化合物如山萘酚和斛皮素糖苷对两种酶的抑制活性最强，而儿茶素、表儿茶素和原花青素等黄烷醇类化合物没有明显的抑制活性。
　　6．与亲脂性提取物相比，亲水性提取物具有更强的体外化学抗氧化活性。小扁豆中主要含有可溶性酚类化合物（不溶性酚类化合物仅占其含量5%左右）。烹煮过程对小扁豆中类胡萝卜素、生育酚、可溶性酚类和不溶性酚类提取物中的总酚、缩合单宁含量，以及抗氧化活性都有显著影响(P<0.05)。具体来说，烹煮过程增加了类胡萝卜素、生育酚和黄酮醇类化合物（山萘酚糖苷等）的含量，而减少了黄烷醇类化合物（儿茶素和缩合单宁等）的含量。烹煮后，黄烷醇类化合物以及其他酚类化合物含量的减少会降低体外化学抗氧化活性，而其他植物化学物，特别是脂溶性化合物的抗氧化活性增强。
　　7．用体外模拟消化研究了小扁豆 Greenland被食用后在胃肠道的生物可接受率。结果表明：小扁豆可溶性酚类提取物中总黄酮类化合物的生物可接受率最高，为66.67%，缩合单宁的生物可接受率最低，为26.54%。体外模拟胃部消化后黄烷醇类化合物（儿茶素和表儿茶素糖苷等）生物可接受率最高，在50%左右，酚酸类化合物的生物可接受率大约为21-45%，而黄酮醇类化合物（山萘酚和斛皮素糖苷等）的生物可接受率最低，大约为20%。继续体外模拟肠道消化后，酚酸类化合物全部降解，黄烷醇类化合物的生物可接受率显著降低(p<0.05)，而黄酮醇类化合物的生物可接受率明显升高至55-65%(p<0.05)。利用 Caco-2细胞建立细胞抗氧化模型，发现消化前后小扁豆可溶性酚类提取物具有很强的细胞抗氧化活性。消化前后小扁豆可溶性酚类化合物能保护由H2O2诱导的caco-2细胞的氧化应激损伤，且呈浓度依赖关系。
　　8．利用TNF-α诱导caco-2细胞建立细胞炎症模型，煮熟的小扁豆可溶性酚类提取物能够显著地抑制炎症细胞释放促炎因子 IL-8，显著地下调促炎因子IL-6、IL-1β和COX-2 mRNA的表达水平，且浓度与抑制活性呈正相关。

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第1章引言

1.1小扁豆

1.2小扁豆中主要植物化学物组成的研究现状

1.3小扁豆的生物活性

1.4本课题研究的目的、意义及主要内容

第2章不同品种小扁豆中的脂溶性植物化学物

2.1前言

2.2试验材料与设备

2.3实验方法

2.4统计学分析

2.5结果

2.6讨论

2.7小结

第3章不同品种小扁豆中的可溶性酚类化合物

3.1前言

3.2实验材料与设备

3.3实验方法

3.4统计学分析

3.5结果

3.6讨论

3.7小结

第4章不同品种小扁豆对相关的消化酶的抑制作用

4.1前言

4.2实验材料与设备

4.3实验方法

4.4统计学分析

4.5结果

4.6讨论

4.7小结

第5章烹煮对小扁豆植物化学物和抗氧化活性的影响

5.1前言

5.2实验材料与设备

5.3实验方法

5.4统计学分析

5.5结果

5.6讨论

5.7小结

第6章烹煮后小扁豆可溶性酚类提取物的生物可接受率和细胞抗氧化活性

6.1前言

6.2实验材料与设备

6.3试验方法

6.4统计学分析

6.5结果

6.6讨论

6.7小结

第7章烹煮后小扁豆可溶性酚类提取物的抗炎活性

7.1前言

7.2实验材料与设备

7.3试验方法

7.4统计学分析

7.5结果

7.6讨论

7.7小结

第8章结论与展望

8.1结论

8.2进一步工作方向

创新之处

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果