基于DNA链取代放大技术的甲基转移酶活性比色传感新方法研究

摘要

DNA甲基化是最重要的表观遗传修饰之一，也是研究最充分的表观遗传学之一。甲基化过程会显著影响基因的表达、细胞分化、转录沉默、X染色体失活且DNA甲基化与很多基因疾病和癌症有着密切的联系。不同类型的甲基转移酶（methyltransferases，MTase）会引起不同的异常DNA甲基化。因此研究 DNA甲基转移酶活性及其抑制剂对临床诊断和治疗具有重要的意义。本论文以研究DNA甲基转移酶活性为目的，构建了基于AuNPs的比色传感器，主要包括以下三部分内容：
　　1、概述了DNA甲基化及AuNPs比色传感器。DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰，它在原核和真核细胞中都有重要作用。DNA甲基化对正常细胞的生长过程，如细胞分化、转录沉默、基因调控、X染色体失活和一些其它过程都有极大影响。目前，研究DNA甲基化主要是研究DN A甲基转移酶及其抑制剂。DNA甲基转移酶分析及其抑制剂筛选的方法多种多样。基于AuNPs的比色传感器，凭借AuNPs的生物亲和性，表面易于修饰，团聚前后颜色变化明显等优势被广泛应用于生物检测。
　　2、构建了一种基于AuNPs的比色传感器用于直接分析 M.SssI活性。实验以精心设计的发夹DNA（HPI）为甲基化基质，以修饰在AuNPs表面上的短链DNA为探针，通过DNA杂交作用使AuNPs发生团聚，并对不同浓度的M.SssI有很好的响应。本方法对M.Sss I响应的线性范围为2-50 U/mL，最低检测限为0.84 U/mL。我们建立的AuNPs比色法直接检测 M.SssI活性的方法，具有操作简单、选择性好、无需标记等特点。
　　3、构建了一种基于链取代放大技术的DNA甲基转移酶活性比色检测方法。首先设计一个颈部含有5'-CCGG-3'序列的发夹DNA I(HPI)，它能被CpG甲基转移酶 M.SssI和HpaII限制性内切酶识别。发生甲基化的HPI能与溶液中其它DNA、酶共存，然而未甲基化的HPI则被剪切成单链DNA（ssDNA）碎片。ssDNA碎片中的region I可以与另一个发夹DNA（HPII）杂交，将发夹打开并形成双链结构。当向以上溶液中加入AuNPs-DNA时，两种AuNPs-DNA上的探针DNA与HPII部分杂交且其稳定性大于region I与HPII形成的双链，因此region I被取代下来，并进入下个循环。这样大量的AuNPs-DNA被HPII连接起来，使得AuNPs发生聚集而吸收光谱蓝移且吸光度降低。结果表明，当 M.SssI浓度在0.2-50 U/mL范围内，吸光度A/A0值与logCM.SssI呈良好的线性相关，检测限为0.08 U/mL。与直接比色传感相比，基于链取代放大技术的比色传感对M.Sss I活性检测具有更高的灵敏度和更低的背景信号。另外，本方法也可用于甲基转移酶抑制剂的筛选，抑制剂5-Aza和5-Aza-dC对M.SssI的半抑制浓度分别为2.4和0.37μM。

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第1章 绪 论

1.1 概述

1.1.1 表观遗传学概述

1.1.2 DNA甲基化概述

1.2 甲基转移酶抑制剂

1.2.1 核苷类抑制剂

1.2.2 植物药类

1.2.3 抗生素

1.3 DNA甲基化及抑制剂的研究方法

1.4 比色传感器

1.4.1 比色传感器简介

1.4.2 AuNPs的制备

1.4.3 AuNPs功能化

1.5 本文拟开展的工作

第2章 直接法比色分析甲基转移酶的活性

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 仪器和试剂

2.1.2 AuNPs的制备与修饰

2.1.3 M.SssI活性检测

2.1.4 选择性分析

2.3 结果与讨论

2.3.1 实验原理

2.3.2 AuNPs及DNA-AuNPs的紫外表征

2.3.3 可行性分析

2.3.4 暗场表征

2.3.5 M.SssI活性检测

2.3.6 选择性研究

2.3.7 实际样考察

2.4 结论

第3章 基于链取代放大技术高灵敏检测甲基转移酶活性

3.1 引言

3.2实验部分

3.2.1试剂和仪器

3.2.2 AuNPs的制备与修饰

3.2.3 M.SssI活性检测

3.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.2.5 选择性研究

3.2.6 抑制剂的筛选

3.3 结果与讨论

3.3.1 实验原理

3.3.2 可行性分析

3.3.3 透射电镜表征

3.3.4 优化实验条件

3.3.5 M.sssI的活性检测

3.3.6 选择性考察

3.3.7 抑制剂的筛选

3.4 结论

第4章 总结与展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间的研究成果