减少大鼠肾缺血再灌注损伤的方法对比研究

摘要

目的：
　　本研究将通过夹闭SD大鼠肾动脉制造肾脏缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）模型，在再灌注前后使用缺血后处理（ischemic postconditioning，IPostC）、远程缺血预处理（remote ischemic preconditioning，RIPC）、肌苷注射液及HC-A肾保护液灌注处理等方法，缺血再灌注24小时、48小时、1周后检测大鼠下腔静脉血中尿素氮（BUN）及血清肌酐（Cr）的含量。通过组织病理学评价肾小管损伤程度，并检测肾组织中髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的活性以评估组织过氧化损伤的程度，综合比较这几种处理方法对肾IRI的保护作用。
　　方法：
　　选用成年健康雌性SD大鼠，体重约220±30g，随机分假手术组（Sham组）、IR组、RIPC组、IPostC组、肌苷注射液处理组（肌苷组）和HC-A肾保护液灌注组（HC-A组）。各组SD大鼠开腹切除右侧肾脏，夹闭左肾动脉45分钟后恢复灌注，观察肾动脉搏动及肾脏颜色变化，肾动脉恢复搏动，肾脏颜色由暗红转变红润，表示灌注成功。经过上述处理干预后再灌注24小时、48小时及1周，分别抽取大鼠下腔静脉血，用于检测血清Cr和BUN评估肾功能。切除左肾，取部分肾组织用液氮低温处理后转入冰箱中-80℃下保存，用于检测肾组织MDA、SOD及MPO酶活性。另部分肾组织放入4％多聚甲醛溶液中固定，用于苏木精-伊红（HE）染色制片。在光学显微镜下，按照Paller评分方法，每张玻片选5个不同的视野，每个视野随机选择10个肾小管，用评估肾小管上皮细胞损伤程度。数据分析应用统计软件SPSS19.0，均数±标准差（x?s）表示，采用单因素方差分析比较组间差异，P＜0.05为有统计学意义。
　　结果：
　　1、肾功能评价
　　再灌注24小时和48小时后，IR组、PostC组、RIPC组、肌苷组、HC-A组与Sham组比较，血清中Cr显著升高（p<0.05）；再灌注24小时后，PostC组、RIPC组、肌苷组及HC-A组与IR组比较，血清Cr显著降低（p<0.05）；IPostC组和RIPC组与HC-A组比较，血清Cr降低（p<0.05）；再灌注48小时后，IPostC组、RIPC组、肌苷组与IR组及HC-A组比较，血清Cr降低（p<0.05）；1周后，IPostC组、RIPC组、肌苷组和HC-A组的血清Cr仍低于IR组（p<0.05），与Sham组无明显差异。再灌注24小时后IR组和HC-A组血清BUN与Sham组比较明显升高（p<0.05）；PostC组、RIPC组、肌苷组及HC-A组与IR组比较，血清BUN降低（p<0.05）；PostC组和RIPC组较HC-A组血清BUN降低（p<0.05）。再灌注48小时后，IR组和IPostC组血清BUN与Sham组比较升高（p<0.05），IPostC组、RIPC组和肌苷组与IR组比较，血清BUN水平降低（p<0.05）。
　　2、肾组织病理观察
　　Sham组大鼠肾组织形态结构未见明显异常，IR组中再灌注24小时、48小时后肾组织结构严重损伤，肾小管上皮细胞变性坏死，管腔扩张，内可见大量坏死细胞；再灌注1周后肾组织中可见轻度局灶性炎症和点状坏死。IPostC组、RIPC组、肌苷组和HC-A组再灌注24小时和48小时后和IR组比较发现肾组织损伤减轻，肾小管上皮细胞水肿减轻，官腔轻中度扩张，腔内可见少许炎性细胞聚集。再灌注1周后肾组织形态结构基本恢复，部分可见肾小管轻度水肿；
　　3、肾组织MPO活性变化
　　再灌注24小时后，IR组、IPostC组、RIPC组、HC-A组与Sham组比较，肾组织中MPO活性显著升高（p<0.05）；再灌注48小时后，IR组、RIPC组、肌苷组和HC-A组与Sham组比较，肾组织中MPO活性升高（p<0.05）；灌注24小时和48小时后，IPostC组、RIPC组和肌苷组与IR组对比，肾组织MPO的活性显著降低（p<0.05）；
　　4、肾组织MDA活性变化
　　再灌注24小时和48小时后，IR组、IPostC组、RIPC组、肌苷组、HC-A组与Sham组比较，肾组织中MDA活性显著升高（p<0.05）；再灌注24小时后，IPostC组、RIPC组、肌苷组、HC-A组与IR组比较，肾组织中MDA活性显著降低（p<0.05）；IPostC组和RIPC组与HC-A组对比，MDA活性降低（p<0.05）；再灌注48小时后，IPostC组、RIPC组和肌苷组与IR组比较，MDA活性降低（p<0.05）。
　　5、肾组织SOD活性变化
　　再灌注24小时和48小时后，IR组、IPostC组、RIPC组、肌苷组、HC-A组与Sham组比较，肾组织中SOD活性明显降低（p<0.05）；IPostC组、RIPC组、肌苷组和HC-A组肾组织中SOD活性与IR组对比则增高了（p<0.05）；再灌注1周后，HC-A组与Sham组比较，SOD活性降低（p<0.05）。
　　结论：
　　IRI肾病理表现为肾组织细胞结构和功能异常，Cr和BUN升高，MDA、MPO活性升高，SOD活性下降；实验结果显示，IPostC、HC-A肾保护液、RIPC及肌苷注射液处理等对IRI肾具有保护作用；其可通过降低MDA和MPO酶活性，提高SOD酶清除氧自由基能力等抗氧化机制，而达到保护肾功能作用。研究表明RIPC对IRI肾有保护作用，且和IPostC、肌苷注射液处理比较无明显差异，较HC-A肾保护液处理对IRI肾更具有保护作用，因其操作简易、无创伤、效果明确等优点，因此具有更广阔的临床应用前景。

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中英文缩略词表

第1章 前言

第2章 实验材料与仪器

2.1 实验动物

2.2 主要试剂和仪器设备

第3章 实验方法

3.1 动物模型的制备和分组

3.2 观测指标及方法

3.3 数据统计学处理

第4章 结果

4.1 大鼠术后存活时间

4.2 大鼠肾功能变化

4.3 肾组织病理学变化

4.4 大鼠肾组织MPO活性的变化

4.5 大鼠肾组织MDA含量的变化

4.6 大鼠肾组织SOD活性的变化

第5章 讨论

第6章 结论

致谢

参考文献

附图

综述: 远程缺血处理的机制及临床应用