miR-203在人表皮干细胞和角质形成细胞中的表达与调控研究

摘要

表皮干细胞是皮肤组织中的特异性成体干细胞，主要位于表皮基底层和毛囊外根鞘膨凸部，具有极强的增殖、分化潜能及自我更新能力，在维持皮肤及其附属器正常的结构与功能、皮肤的创伤修复等方面发挥着重要作用。因此，表皮干细胞被认为是构建组织工程皮肤的理想种子细胞。充分了解表皮干细胞调控机制是其临床应用的重要前提和理论依据。国内外现有研究主要集中在干细胞壁龛、Wnt信号转导通路、Notch信号转导通路、原癌基因和抑癌基因表达等途径上，且已取得一定进展，但其确切机制还远未澄清。
　　研究表明，微小RNA（microRNA,miRNA)作为内源性非编码单链RNA，在细胞增殖与分化、细胞凋亡、信号转导、器官发育、免疫调节、脂肪代谢、炎症反应、肿瘤形成、衰老与死亡及疾病的发生发展等许多生物过程中发挥重要作用。近期研究证实，miRNA广泛参与调控皮肤及其附属器的形成和稳态，并与皮肤再生修复密切相关，其中miR-203在皮肤中存在特异性表达。但miRNA特别是 miR-203在人表皮干细胞和角质形成细胞中的表达变化、作用及其调控机制，目前尚不十分清楚。
　　因此，本课题拟通过miRNA芯片检测技术筛选体外培养的人表皮干细胞与角质形成细胞中miRNA的差异表达谱，并比较观察miR-203与p63在人表皮干细胞和角质形成细胞中的表达变化，分析其相关性；通过脂质体转染技术将miR-203抑制物导入体外培养的人角质形成细胞中，观察下调miR-203诱导角质形成细胞去分化形成表皮样干细胞的作用及其机制；通过脂质体转染技术将miR-203模拟物导入体外培养的人表皮干细胞中，观察上调miR-203诱导表皮干细胞向汗腺样细胞分化的可能性。旨在进一步明确 miR-203在人表皮干细胞和角质形成细胞中的表达变化、作用及其调控机制，为其在创面修复与皮肤组织工程中的应用提供新思路及理论依据。
　　第一部分人表皮干细胞与角质形成细胞miRNA的差异表达谱分析
　　目的：观察体外培养的人表皮干细胞和角质形成细胞miRNA表达谱的差异，预测其靶基因与增殖分化的关系。
　　方法:（1）取泌尿外科行包皮环切术患者的正常包皮组织，采用酶消化和Ⅳ型胶原快速贴壁方法获得人表皮干细胞、角质形成细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况，免疫细胞化学染色法行β1整合素、CK1、CK10、CK19单抗检测鉴定。（2）Trizol一步法分别提取2组细胞总 RNA，甲醛变性胶电泳质检。mirVana?miRNA分离试剂盒对其进行纯化，使用miRNA标记和杂交试剂盒进行荧光标记及芯片杂交，利用Feature Extraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析，GeneSpring(GXl0.0)软件进行数据归一化及差异分析，同时应用 RT-PCR法验证miRNA芯片结果的可靠性。（3）预测部分差异表达的miRNA的靶基因。
　　结果：（1）快速黏附于Ⅳ型胶原的细胞群培养3 d能形成明显克隆，免疫细胞化学染色显示β1整合素及CK19呈阳性表达，为表皮干细胞；不能快速黏附于Ⅳ型胶原的细胞群培养3 d无明显克隆形成，CK1及CK10呈阳性表达，为角质形成细胞。（2）筛选出人表皮干细胞中表达上调的miRNA31个，表达下调的miRNA153个。其中显著上调的miRNA有hsa-miR-125b-3p、hsa-miR-197-5p、hsa-miR-376a-3p等；显著下调的 miRNA有 hsa-miR-203、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34a-3p等。其中上调的 hsa-miR-197-5p和下调的 hsa-miR-29b-3p的RT-PCR验证结果与芯片检测结果具有较好的一致性。（3）miRNA靶基因预测提示部分miRNA与细胞增殖分化、凋亡衰老等生物学特性有关。
　　结论：体外培养的人表皮干细胞与角质形成细胞 miRNA表达谱存在明显差异，可能与两者不同的增殖分化能力等生物学特性有关。
　　第二部分 miR-203与p63在人表皮干细胞和角质形成细胞中的表达变化
　　目的：观察miR-203与p63在体外培养人表皮干细胞和角质形成细胞中的表达变化，探讨其在表皮增殖分化中的作用及意义。
　　方法：实时荧光定量 RT-PCR检测体外培养人表皮干细胞和角质形成细胞miR-203、p63 mRNA表达，蛋白质印迹法检测p63蛋白表达。对数据行t检验、Pearson相关分析。
　　结果：人表皮干细胞miR-203的mRNA相对表达量为0.74±0.20,较角质形成细胞的3.66±0.34明显下调（t=16.582，P＜0.001）。表皮干细胞p63的mRNA相对表达量为4.16±0.28较角质形成细胞的2.90±0.39明显上调（ t=5.850， P=0.001）。表皮干细胞 p63的蛋白相对表达量为1.42±0.05,较角质形成细胞的0.73±0.03明显上调（t=26.460，P＜0.001）。miR-203的mRNA表达量与p63的mRNA和蛋白表达量均呈明显负相关（r值分别为-0.938、-0.976，t值分别为4.687、7.763，P值分别为0.019、0.005）。
　　结论：miR-203在体外培养人表皮干细胞中的表达明显低于角质形成细胞，而 p63在人表皮干细胞中的表达显著高于角质形成细胞，可能参与表皮干细胞和角质形成细胞的增殖与分化。
　　第三部分 miR-203下调促进人角质形成细胞去分化形成表皮样干细胞
　　目的：探讨 miR-203下调促进体外培养人角质形成细胞去分化形成表皮样干细胞的可能性及机制，为构建组织工程皮肤促进创面的解剖修复提供新的种子细胞来源。
　　方法：根据人源 miR-203序列，设计并合成其单链抑制物。通过脂质体转染将 miR-203抑制物导入体外培养人角质形成细胞（实验组），转染对照miRNA抑制物作为对照组。对转染前及转染后72 h的细胞通过免疫细胞化学染色法行ITGB1、CK19、CK1、CK10单克隆抗体检测鉴定；实时荧光定量RT-PCR检测miR-203、p63、ITGB1、CK19、CK1、CK10 mRNA相对表达量；Western blot法检测 p63、ITGB1、CK19、CK1、CK10蛋白相对表达量；并对 miR-203的mRNA表达与 p63的 mRNA和蛋白表达分别行 Pearson相关分析。
　　结果：实验组转染后72 h的细胞ITGB1、CK19呈阳性表达。miR-203的mRNA相对表达量显著低于转染前，p63、CK19、ITGB1的mRNA及蛋白的相对表达量均高于转染前及对照组，而CK1、CK10的mRNA及蛋白的相对表达量均低于转染前和对照组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。上述指标对照组与转染前比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。转染前后 miR-203的 mRNA表达量与p63的mRNA和蛋白相对表达量均成负相关（P＜0.05）。
　　结论：miR-203抑制物能诱导人角质形成细胞去分化为表皮样干细胞，靶基因p63表达上调可能是其重要机制之一。
　　第四部分 miR-203转染诱导人表皮干细胞向汗腺样细胞分化
　　目的：探讨 miR-203转染诱导体外培养人表皮干细胞向汗腺样细胞分化的可能性及机制，为实现创面的功能愈合提供实验依据及新途径。
　　方法：通过脂质体转染将 miR-203模拟物导入体外培养人表皮干细胞（实验组），转染对照miRNA模拟物作为对照组。对转染前及转染后72 h的细胞通过免疫细胞化学染色法行ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA单克隆抗体检测鉴定；实时荧光定量RT-PCR检测miR-203、p63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA mRNA相对表达量；Western blot法检测p63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA蛋白相对表达量；并对miR-203的mRNA表达与 p63的 mRNA和蛋白表达分别行 Pearson相关分析。
　　结果：实验组转染后72 h的细胞CK1、CK10、CK18、CEA呈阳性表达。miR-203 mRNA相对表达量显著高于转染前，CK1、CK10、CK18、CEA mRNA及蛋白的相对表达量均高于转染前及对照组，而p63、CK19、ITGB1 mRNA及蛋白的相对表达量均低于转染前和对照组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。上述指标对照组与转染前比较差异均无统计学意义（ P＞0.05）。转染前后miR-203的mRNA表达量与p63的mRNA和蛋白相对表达量均成负相关（P＜0.05）。
　　结论：miR-203能诱导人表皮干细胞分化为汗腺样细胞，其作用可能是通过靶向抑制p63来实现的。
　　全文小结：
　　（1）体外培养的人表皮干细胞与角质形成细胞miRNA表达谱存在明显差异，可能与两者不同的增殖分化能力等生物学特性有关。
　　（2） miR-203在体外培养人表皮干细胞中的表达明显低于角质形成细胞，而p63在人表皮干细胞中的表达显著高于角质形成细胞，miR-203与p63基因及蛋白表达呈负相关。p63的mRNA可能是miR-203的靶基因，miR-203可能通过抑制p63参与调控表皮细胞的增殖分化。
　　（3） miR-203下调能够诱导体外培养的人角质形成细胞去分化为表皮样干细胞，且去分化源性表皮样干细胞与机体自身来源的表皮干细胞形态及生物学特性相似。靶基因p63表达上调可能是其重要机制之一。
　　（4） miR-203能诱导体外培养的人表皮干细胞分化为汗腺样细胞，其作用可能是通过靶向抑制p63来实现的。

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中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 人表皮干细胞与角质形成细胞miRNA的差异表达谱分析

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

第3章 miR-203与p63在人表皮干细胞和角质形成细胞中的表达变化

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第4章 miR-203下调促进人角质形成细胞去分化形成表皮样干细胞

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

第5章 miR-203转染诱导人表皮干细胞向汗腺样细胞分化

5.1 材料与方法

5.2 结果

5.3 讨论

5.4 小结

全文小结

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: 微小RNA在皮肤发育及创面愈合中的作用 ?