Hippo信号通路在调节卵巢生殖干细胞功能和延缓卵巢衰老中的作用

摘要

背景：如今，随着老龄化社会的出现，衰老问题逐渐被人们所重视。在女性，卵巢衰老的速度要明显快于机体其它器官。卵巢衰老影响生殖健康，引发绝经期的到来、癌症和多种慢性疾病的发生。然而，随着生存环境的日益恶化、生活压力不断加大及药物治疗副作用等因素对女性卵巢功能的损害，使卵源性不孕症及病理性卵巢功能衰退已成为困扰现代女性的重大社会卫生问题。特别是随着二胎政策的实施，高龄女性对于生活质量以及生育寿命的需求日益强烈。故阐明卵巢功能的生理及病理性减退机制、建立有效的干预手段，已成为医学界刻不容缓的研究课题！近年来卵巢生殖干细胞（ovarian germline stem cells，OGSCs）的发现能为有效地增加原始卵泡池、改善卵巢功能、延缓卵巢衰老带来前所未有的希望！
　　Hippo信号通路是调控成体干细胞增殖分化及功能的重要信号通路，我们前期研究发现 Hippo信号通路的主要效应因子能触发原始卵泡的启动。但 Hippo信号通路是否参与OGSCs功能的调控以及和生理性及病理性卵巢功能衰老的关系还有待进一步证实。因此本研究中，以 KM系小鼠及人卵巢皮层组织为实验对象：①分析Hippo信号通路的主要效应因子在卵巢表面上皮（ovarian surface epithelium,OSE）细胞中的表达及动态变化，这种变化与卵巢功能生理性衰老和病理性衰老的关系；②离体观察Hippo信号通路的主要效应因子YAP1在OGSCs增殖分化中的作用；③在体分析YAP1经卵巢内微注射对卵巢功能生理性衰老和病理性衰老的拯救作用。通过实验为深入探讨成年哺乳动物OGSCs的自我更新、分化及衰老等的生物学过程提供重要材料，为不孕症的治疗、重塑和保护卵巢功能提供技术方法和新的药物作用靶点。
　　第一部分、Hippo信号通路主要分子在生理性衰老和病理性衰老卵巢生殖上皮细胞中的表达及动态变化
　　目的：分析Hippo信号通路的主要分子在卵巢生殖上皮（OSE）细胞中的表达及动态变化，这种变化与卵巢功能生理性衰老和病理性衰老的关系。
　　方法：选用7日龄（7days,7D）、2月龄（2months,2M）、10月龄（10months,10M）和20月龄（20months,20M）小鼠卵巢，以及生育旺盛期（青春期后-35岁）、中年期（36-50岁）和绝经期（51-60岁）人卵巢皮层样本为生理性衰老卵巢实验标本；通过雷公藤灌胃（Tripterygium Glycosides,TPT）及环磷酰胺/马利兰片（Cyclophosphamide/Busulfan,CY-BUS）腹腔注射方式，构建病理性衰老卵巢模型。分别经HE染色，免疫化学方法及分子生物学方法等技术，比较Hippo信号通路的主要分子（LATS2，MST1与YAP1）在OSE细胞中的表达及动态变化，以及这种变化与卵巢功能生理性衰老和病理性衰老的关系。
　　结果：
　　（1）在不同年龄小鼠OSE中存在Hippo信号通路相关分子与OGSCs标记因子（MVH与OCT4）共表达。其中，抑癌因子LATS2，MST1与MVH/OCT4的表达随着年龄的增加而逐渐降低；原癌因子YAP1则在2M小鼠OSE中表达量最高，7D龄其次，20M最低；pYAP1表达则为7D最高，且pYAP1/YAP1比值随年龄增加而逐渐降低。
　　（2）在病理性卵巢衰老模型小鼠OSE中也存在Hippo信号通路相关分子与OGSCs标记因子（MVH与OCT4）共表达。其中，YAP1，MST1与MVH/OCT4在雷公藤和环磷酰胺/马利兰片两组药物造成的衰老模型组中均表现为逐渐降低，而LATS2的表达则呈现出相反趋势。pYAP1在两组病理性卵巢衰老小鼠卵巢中均显著降低，而pYAP1/YAP1的比值则均显著升高。
　　（3）在不同年龄阶段人OSE中同样存在Hippo信号通路相关分子与OGSCs标记因子（MVH与OCT4）共表达。其中，MVH/OCT4随着年龄的增长而逐渐下降，LATS2表达为青春期最高，YAP1和pYAP1为中年期最高，而MST1则为老年期最低；pYAP1/ YAP1则显示出从青年期到老年期逐渐降低的趋势。
　　结论：Hippo信号通路相关分子LATS2，MST1与YAP1和OGSCs标记因子MVH与OCT4共表达于小鼠和人OSE中，两者表达的变化存在明显的时序相关性，且这种变化与卵巢功能的生理性衰老和病理性衰老亦存在明显的时序相关性。表明，Hippo信号通路可能通过调控OGSCs参与了卵巢功能的生理性衰老和病理性衰老过程。
　　第二部分、Hippo信号通路在卵巢生殖干细胞增殖和分化中的作用
　　目的：进一步完善卵巢生殖干细胞（OGSCs）的分离、鉴定与培养方法；探明Hippo信号通路对OGSCs增殖分化的影响。
　　方法：采用两步酶分离方法及特异性抗体磁珠筛选技术（magnetic activated cell sorting，MASC）对OGSCs进行分离，通过测定MVH，OCT4，Nango，Fraglis，Stella等多种干细胞和生殖细胞特异性标记因子对OGSCs进行鉴定，选用本室改良的方法对OGSCs进行培养；将携带效应因子YAP1的过表达和相应shRNA的干扰慢病毒载体转染至OGSCs，观察对OGSCs增殖和分化的影响。
　　结果：
　　（1）经上述方法分离得到的细胞能共表达MVH，OCT4，Nango，Fraglis，Stella等干细胞和生殖细胞特异性标记因子，故而初步鉴定所得细胞为OGSCs。
　　（2）LATS2，MST1及YAP1可在OGSCs上表达；OGSCs在转染YAP1过表达慢病毒载体后，其特异性标记因子MVH，OCT4的表达显著升高，而在转染YAP1shRNA的干扰慢病毒载体后，MVH，OCT4的表达则显著降低。
　　结论：已初步建立了OGSCs的分离、鉴定与培养方法；Hippo信号通路相关分子存在于OGSCs，并能调控OGSCs体外增殖。
　　第三部分、Hippo信号通路通过调控卵巢生殖干细胞的功能在卵巢功能重塑中的作用初探
　　目的：在体进一步验证Hippo信号通路通过调控卵巢生殖干细胞（OGSCs）增殖和分化在卵巢功能重塑中的作用。
　　方法：选用Hippo信号通路中主要效应因子YAP1为靶基因，通过卵巢内微注射将携带效应因子YAP1的过表达和相应shRNA的干扰慢病毒载体分别转染至不孕模型和生育旺盛期小鼠卵巢，观察对卵巢生殖功能和内分泌功能的影响。
　　结果：
　　（1）不孕模型小鼠在转染过表达YAP1后的30-75天期间，可以检测到卵巢内有卵泡再生，原始卵泡启动激活，子代出生率增加，同时伴有血清中E2和FSH水平上升，卵巢OSE细胞中YAP1与pYAP1表达和MVH与OCT4表达均明显增高。
　　（2）生育旺盛期小鼠在转染YAP1的干扰慢病毒载体后的30-75天期间，检测到卵巢内卵泡数量下降，子代出生率减少，同时伴有血清中E2和FSH水平下降，卵巢OSE细胞中YAP1与pYAP1表达和MVH与OCT4表达均明显降低。
　　结论：调控Hippo信号通路效应分子YAP1可在卵巢功能重塑中发挥重要作用。

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中英文缩略词表

第1章 引言

1.1 卵巢生殖干细胞的发现挑战了垄断生殖医学界近一百年的“卵泡池固定理论”

1.2卵巢生殖干细胞（OGSCs）的衰老可能是卵巢衰老的根本原因

1.3 Hippo信号通路在雌性生殖系统中的研究

第2章 Hippo信号通路主要分子在生理性衰老和病理性衰老卵巢生殖上皮细胞中的表达及动态变化

2.1 引言

2.2 材料与试剂

2.3 实验方法

2.4结果与分析

2.5 讨论

第3章 Hippo信号通路在卵巢生殖干细胞增殖和分化中的作用

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 结果

3.5 讨论

第4章 Hippo信号通路通过调控卵巢生殖干细胞的功能在卵巢功能重塑中的作用初探

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 结果

4.5 讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 下一步工作

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述一:Hippo信号通路在雌性生殖系统中的研究进展

综述二:Notch信号通路与生殖干细胞研究进展