肽基凝胶诱导NT-3基因修饰BMSCs向神经细胞分化研究

摘要

研究目的：
　　构建体外脊髓组织工程模块，探讨在含IKVAV肽基凝胶三维培养下，NT-3基因修饰的BMSCs向神经细胞分化情况。
　　研究方法：
　　1、采用全骨髓贴壁法分离、培养细胞，进行形态学观察、流式细胞术表面抗原检测、观察其向成脂方向诱导分化，CCK-8绘制细胞生长曲线。
　　2、使用NT-3过表达腺病毒（Ad-NT-3-RFP）对BMSCs进行基因修饰，48h后荧光显微镜下观察标记蛋白RFP在转染后BMSCs中表达情况，ELISA法检测修饰后BMSCs NT-3蛋白表达情况。
　　3、通过含细胞的培养液促发多肽溶液自组装形成三维培养体系，实验分成三组：凝胶-NT3组（经NT-3病毒转染后三维培养）、凝胶-RFP组（经RFP对照病毒转染后三维培养）、NT-3组（只经NT-3病毒转染）。运用qRT-PCR及Western blot检测各组BMSCs细胞中MAP-2、GFAP mRNA及蛋白表达水平。
　　研究结果：
　　1、分离获取的BMSCs呈梭行，流式细胞测定显示细胞高表达CD29，不表达CD34，经成脂诱导2周出现脂滴，油红O染色成红色。
　　2、使用Ad-NT-3-RFP转染BMSCs48h后，细胞中出现明显的RFP表达，细胞转染效率均在90％以上。ELISA检测细胞培养液中NT-3含量，细胞液中第1天就开始出现NT-3蛋白，第3天NT-3蛋白浓度明显升高。到第5天后，每天培养液中NT-3蛋白浓度未出现明显差异。
　　3、qRT-PCR和Western blot结果显示：凝胶-NT3组中MAP-2、GFAP mRNA及蛋白表达水平较凝胶-RFP组和NT-3组明显增高，差异有统计学意义（ P＜0.05）。
　　结论：
　　含IKVAV肽基凝胶具有明显诱导NT-3基因修饰的BMSCs向神经细胞分化的作用。