X线及基因沉默对人血管内皮细胞BRCA1、p21表达和细胞周期的影响

摘要

目的：
　　采用6MV X线照射人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell， HUVEC）以及RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)沉默内皮细胞的乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene1, BRCA1）后，观察对细胞BRCA1和p21基因表达，细胞周期停滞及细胞凋亡的影响,探讨“BRCA1-p21-细胞周期”轴在放射性心脏损伤发挥保护作用的可能性。
　　方法：
　　1.通过免疫蛋白印迹（Western blot）检测HUVEC在总照射剂量为20Gy的X线照射0、2、4、6、8、10、24、48h后，BRCA1和p21蛋白表达量改变。再检测HUVEC在剂量梯度为0、2、4、6、8、10、12、20Gy的X线照射后4h， BRCA1和p21蛋白表达量改变。
　　2.流式细胞仪检测HUVEC在总照射剂量为20Gy的X线照射0、2、4、6、8、10、24、48h后细胞周期分布。再检测HUVEC在剂量梯度为0、2、4、6、8、10Gy的X线照射后24h细胞周期分布。
　　3.设计并化学合成针对BRCA1的3对小干扰RNA(small interfering RNA， siRNA)，采用阳离子脂质体法进行瞬时转染。设正常组、siRNA对照组以及siRNA-BRCA1-4341、siRNA-BRCA1-951、siRNA-BRCA1-410转染组。
　　4.通过Western blot检测转染后各组细胞中BRCA1蛋白表达水平，选择沉默有效的siRNA序列用于后续实验。
　　5.通过Western blot检测正常组、siRNA对照组及有效沉默组细胞在下调BRCA1后，p21蛋白表达量改变。
　　6.运用流式细胞仪检测细胞转染前后细胞周期分布和细胞凋亡变化。
　　结果：
　　1. Western blot显示HUVEC中BRCA1及p21蛋白的表达随照射后时间的延长而逐渐增加，而且p21在放射线照射后4小时异常表达升高；HUVEC细胞照射4h后，BRCA1及p21蛋白的表达随照射剂量的增加而逐渐增加。
　　2.流式细胞仪检测结果显示，HUVEC细胞周期阻滞随照射时间的增加而逐渐明显，在照射后24h开始出现明显的G2期阻滞；HUVEC照射后细胞G2期阻滞随照射剂量的增加逐渐明显。
　　3.3个特异性BRCA1-siRNAs转染组分别转染48h后，BRCA1的蛋白表达水平与正常组及阴性对照组比较出现下降，三个片段均显示可以有效沉默BRCA1蛋白的表达，而且siRNA-BRCA1-951、siRNA-BRCA1-410转染组明显抑制BRCA1表达并显著下调p21蛋白的表达。
　　4.流式细胞仪检测显示，BRCA1-siRNAs转染组HUVEC的细胞周期G2期阻滞减少，凋亡率增高。
　　结论：
　　1. HUVEC在X线照射后BRCA1和p21蛋白表达明显增加，细胞被阻滞于G2期。
　　2. HUVEC在沉默BRCA1基因后，可能通过下调p21蛋白抑制细胞G2期阻滞并促进细胞凋亡。