藏花酸对CYP3A4、1A2酶活性的影响研究

摘要

藏花酸(Crocetin)又名番红花酸或西红花酸,为砖红色正交结晶,具有多不饱和共轭烯酸结构,来源于茜草科植物栀子果实,属类胡萝卜素物质,是藏红花的主要有效成分之一。其药理作用主要涉及呼吸、神经、心血管及泌尿系统等各方面。本课题组前期研究表明Crocetin主要经CYP3A4、1A2酶代谢。但Crocetin是否对CYP450酶活性存在影响及与其他药物合用是否会产生相互作用等并未进行过深入探讨。因此本课题首先通过大鼠及人肝微粒体孵育体系在体外水平研究Crocetin对CYP3A4、1A2酶的影响,然后再结合大鼠体内实验,进一步考察Crocetin对CYP3A酶活性的影响,以期为Crocetin在临床的合理应用提供相应的理论依据。
　　目的:
　　本实验首先通过体外人、大鼠肝微粒体模型研究Crocetin对主要代谢酶CYP3A4、1A2酶活性的影响,再结合大鼠体内实验,进一步考察Crocetin对CYP3A酶活性的影响,为Crocetin的研究提供更多理论依据。
　　方法:
　　1.建立检测大鼠肝微粒体中咪达唑仑(MDZ)、非那西丁(PHE)及人肝微粒体中MDZ、PHE的HPLC方法;
　　2.建立检测大鼠血浆中MDZ的HPLC方法;
　　3.在体外大鼠、人肝微粒体温孵体系中建立MDZ和PHE各自的最佳温孵时间、最佳蛋白浓度及最适底物浓度;
　　4.通过体外大鼠、人肝微粒体模型,研究各剂量Crocetin对大鼠、人肝微粒体CYP3A4、CYP1A2亚酶活性的影响;
　　5.通过大鼠体内实验,考察单次腹腔注射不同剂量Crocetin,尾静脉注射相同剂量的MDZ后,Crocetin对CYP3A介导的MDZ药代动力学的影响。
　　结果:
　　1.建立了检测大鼠肝微粒体中MDZ、PHE及人肝微粒体中MDZ、PHE的HPLC方法;
　　2.建立了检测大鼠血浆中MDZ的HPLC方法;
　　3.在大鼠肝微粒体实验中,MDZ在37℃,120r/min的条件下进行孵育,在1-40min内,MDZ的消除量随时间的增加而明显增加,故选择的最佳孵育时间为40min;当蛋白浓度在0.05-0.3mg/ml范围内时,蛋白浓度越大,MDZ的消除量就越大,因此确定最佳蛋白浓度为0.3mg/ml;当底物在2.5-10μM浓度范围内时,MDZ代谢量随底物浓度的升高而增加,当底物浓度超过10μM时,MDZ代谢量不再随底物浓度的升高而增加,因此,确定的最佳底物浓度为10μM。PHE在37℃,120r/min的条件下进行孵育,5-40min内,PHE呈线性消除,当超过40min时,PHE消除量很少变化,所以我们选择的最佳孵育时间为40min;在0.1-0.4mg/ml范围内,蛋白浓度越大,PHE的消除量就越多,故确定最佳蛋白浓度为0.4mg/ml;而当底物在5-80μM浓度范围内时,PHE代谢量随底物浓度的升高而增加,当底物浓度超过80μM时,PHE代谢量不再随底物浓度的升高而增加,因此选择的最适底物浓度为80μM;
　　4.在体外大鼠肝微粒体实验中,Crocetin在浓度为0.5-80μM时对CYP3A的酶活性影响均有显著性差异(P＜0.05)。MDZ在Crocetin浓度为0.5-80μM时代谢量的均数分别降低了15.55％、35.27％、48.77％、59.74％、61.72％、67.88％、71.11％(P＜0.05)。Crocetin在浓度为0.5-80μM时对CYP1A2的酶活性影响同样均有显著性差异(P＜0.05)。PHE在Crocetin浓度为0.5-80μM时代谢量的均数分别降低了10.17％、21.38％、33.43％、52.09％、63.01％、77.32％、81.24％(P＜0.05)。且Crocetin对CYP3A、CYP1A2抑制50％酶活性的IC50分别为6.814μM、9.157μM;
　　5.在人肝微粒体实验中,MDZ在37℃,120r/min的条件下进行孵育,在1-30min内,MDZ的消除量随时间的增加而明显增加,当超过30min时,MDZ的消除量不再随时间的增加而增加,故选择的最佳孵育时间为30min;当蛋白浓度在0.05-0.2mg/ml范围内时,MDZ呈线性消除,因此确定最佳蛋白浓度为0.2mg/ml;当底物在2.5-10μM浓度范围内时,MDZ代谢量随底物浓度的升高而增加,当底物浓度超过10μM时,MDZ代谢量不再随底物浓度的升高而增加,因此,确定的最佳底物浓度为10μM。PHE在37℃,120r/min的条件下进行孵育,5-40min内,PHE的消除量随时间的增加而增加,当超过40min时,PHE消除量很少变化,所以我们选择的最佳孵育时间为40min;在0.1-0.4mg/ml范围内,PHE呈线性消除,故确定最佳蛋白浓度为0.4mg/ml;而当底物在5-80μM浓度范围内时,PHE代谢量随底物浓度的升高而增加,当底物浓度超过80μM时,PHE代谢量不再随底物浓度的升高而增加,因此选择的最适底物浓度为80μM;
　　6.在体外人肝微粒体中,Crocetin在浓度为0.5-80μM时对CYP3A4的酶活性影响均有显著性差异(P＜0.01)。MDZ在Crocetin浓度为0.5-80μM时代谢量的均数分别降低了25.36％、32.37％、38.91％、45.96％、51.74％、59.24％、67.72％(P＜0.01)。Crocetin在浓度为0.5-80μM时对CYP1A2的酶活性影响同样均有显著性差异(P＜0.05)。PHE在Crocetin浓度为0.5-80μM时代谢量的均数分别降低了13.48％、30.55％、33.72％、42.67％、48.01％、56.62％、67.43％(P＜0.01)。且Crocetin对CYP3A4、CYP1A2抑制50％酶活性的IC50分别为13.271μM、19.225μM;
　　7.四组MDZ主要药动学参数:空白组AUC(0-t)(361.209mg·L·min-1)、AUC(0-∞)(403.953mg·L·min-1)、MRT(0-t)(37.78 min)、MRT(0-∞)(62.362min)、t1/2z(42.193 min)、CLz(0.07 L·min-1·kg-1)、Vz(1.135 L·kg-1);低剂量组AUC(0-t)(454.895mg·L·min-1)、AUC(0-∞)(499.209mg·L· min-1)、MRT(0-t)(49.004 min)、MRT(0-∞)(75.421 min)、t1/2z(52.806 min)、CLz(0.024 L·min-1·kg-1)、Vz(0.785 L·kg-1);中齐剂量组AUC(0-t)(636.417mg·L·min-1)、AUC(0-∞)(704.421 mg·L·min-1)、MRT(0-t)(57.212 min)、MRT(0-∞)(92.241 min)、t1/2z(64.404 min)、CLz(0.017L· min-1· kg-1)、Vz(0.553 L·kg-1);高剂量组 AUC(0-t)(1050.388mg·L·min-11)、AUC(0-∞)(1177.015mg·L·min-1)、MRT(0-t)(64.681 min)、MRT(0-∞)(107.915 min)、t1/2zz(77.145 min)、CLz(0.006L·min-1·kg-1)、Vz(0.316L·kg-1)。结果表明给药组MDZ的药-时曲线下面积明显比对照组高,提示Crocetin对MDZ的血药浓度存在明显影响,且该影响随Crocetin浓度的增高而加强。
　　结论:
　　1.建立的大鼠肝微粒体中MDZ、PHE及人肝微粒体中MDZ、PHE的HPLC检测方法灵敏可靠;
　　2.建立的大鼠血浆中MDZ的HPLC检测方法灵敏可靠;
　　3.在大鼠肝微粒体中,Crocetin对CYP1A2、CYP3A亚酶活性呈中等程度抑制作用;
　　4.在人肝微粒体中,Crocetin对CYP1A2、CYP3A4亚酶活性则呈现较弱的抑制作用;
　　5.在大鼠体内,给药组MDZ的药-时曲线下面积明显比对照组高,提示Crocetin对MDZ的血药浓度存在明显影响,且该影响随Crocetin浓度的增高而加强。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 藏花酸对大鼠肝微粒体CYP3A、1A2体外活性影响研究

2．1 材料

2．1．1 主要仪器与设备

2．1．2 主要药品与试剂

2．2 方法

2．2．1 标准品溶液配制

2．2．2 MDZ的HPLC检测方法和生物样品处理方法的建立

2．2．3 PHE的HPLC检测方法和生物样品处理方法的建立

2．2．4 探针药物的方法学考察

2．2．5 MDZ在大鼠肝微粒体中的代谢研究

2．2．6 PHE在大鼠肝微粒体中的代谢研究

2．2．7 统计分析

2．3 结果

2．3．1 HPLC方法学评价

2．3．2 MDZ在大鼠肝微粒体中的酶促动力学反应

2．3．3 不同浓度Crocetin对大鼠肝微粒体CYP3A酶活性的影响

2．3．4 PHE在大鼠肝微粒体中的酶促动力学反应

2．3．5 不同浓度Crocetin对大鼠肝微粒体CYP1A2酶活性的影响

2．4 讨论

第3章 藏花酸对人肝微粒体CYP3A4、1A2体外活性影响研究

3．1 材料

3．1．1 主要仪器与设备

3．1．2 主要药品与试剂

3．2 方法

3．2．1 标准品溶液配制

3．2．2 MDZ的HPLC检测方法和生物样品处理方法的建立

3．2．3 PHE的HPLC检测方法和生物样品处理方法的建立

3．2．4 探针药物的方法学考察

3．2．5 MDZ在人肝微粒体体内的代谢研究

3．2．6 PHE在人肝微粒体体内的代谢研究

3．2．7 统计分析

3．3 结果

3．3．1 HPLC方法学评价

3．3．2 MDZ在人肝微粒体中的酶促动力学反应

3．3．3 不同浓度Crocetin对人肝微粒体CYP3A4酶活性的影响

3．3．4 PHE在人肝微粒体中的酶促动力学反应

3．3．5 不同浓度Crocefin对人肝微粒体CYP1A2酶活性的影响

3．4 讨论

第4章 藏花酸对大鼠体内CYP3A介导的咪达唑仑代谢影响研究

4．1 材料

4．1．1 主要仪器与设备

4．1．2 主要药品与试剂

4．1．3 实验动物

4．2 方法

4．2．1 溶液的配制

4．2．2 MDZ的HPLC检测方法和生物样品处理方法的建立

4．2．3 MDZ的方法学考察

4．2．4 给药方法

4．2．5 数据计算及统计分析

4．3 结果

4．3．1 HPLC方法学评价

4．3．2 Crocetin对MDZ在大鼠体内的药代动力学影响

4．4 讨论

第5章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述 藏花酸的研究进展