基于代谢组学的肾癌及肾错构瘤体液诊断标志物研究

摘要

目的:
　　通过代谢组学方法寻找区分正常人群、肾癌及肾错构瘤相关的体液（血液和尿液）特征代谢物组;对这些特征代谢物进行鉴定和确证;建立相关检测方法对部分特征代谢物进行定量分析。筛选优化具有较高特异性及预测准确度的肾癌体液代谢物组，为肾癌的诊断提供参考。
　　方法:
　　以基于核磁共振(1HNMR)和亲水高效液相色谱紫外色谱(HPLC-HILIC-DAD)检测技术的代谢组学为基础，检测健康对照者、肾错构瘤和肾癌患者的血液和尿液，对样品的数据进行多元统计学分析，对区分肾癌的体液特征峰进行鉴定和确证。在此基础上，对氨基酸和尿酸代谢通路部分代谢物进行定量分析。并利用2类logistic回归模型筛选对肾癌诊断有潜在价值的不同代谢物组合。
　　结果:
　　1.发现正常人群、肾癌病人和肾错构瘤患者的体液1HNMR图谱具有不同的代谢表型。和正常组相比，肾癌主要干扰能量代谢如乳酸、醋酸等;氨基酸代谢如丙氨酸和甘氨酸等;肌酐代谢通路等。相对于肾癌组，错构瘤组中部分代谢物的含量更接近与正常组，具有明显的回归正常趋势。其中，氨基酸和肌酐代谢方面肾癌和错构瘤差异明显。
　　2.建立了基于亲水高效液相紫外色谱(HPLC-HILIC-DAD)检测技术的尿液指纹图谱的分析方法。应用化学计量学技术方法对肾癌、错构瘤和正常组人体尿液HPLC-HILIC-DAD指纹图谱进行聚类分析，发现和确证了尿酸、肌酸和肌酐等3种差异代谢物。
　　3.氨基酸柱前衍生化色谱法对正常人、肾癌病人和肾错构瘤患者的血液和尿液样品中氨基酸进行定量分析。结果显示和正常人群相比，肾癌患者血液中的氨基酸水平存在明显的代谢异常。大部分氨基酸含量明显升高而尿液含量下降，与1HNMR数据结果一致。丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、脯氨酸等在血和尿中不同组差异明显，是潜在的区分正常组、肾癌和肾错构瘤的诊断代谢标志物。
　　4.建立了人体体液样品中尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐这四种代谢产物同时分离检测的HPLC-HILIC-DAD亲水色谱方法。以此方法为基础，发现肾癌血液和尿液中黄嘌呤、尿酸、肌酐的含量与正常组比较差异明显，是潜在的区分正常组、肾癌和肾错构瘤的诊断代谢标志物。
　　5.建立了肾癌/正常（错构瘤）的2类logistic回归预测模型，结果表明异亮氨酸、丙氨酸、胆碱、甜菜碱和肌酐5个变量为区分疾病的危险因素，用于正常和肾癌、错构瘤和肾癌2类的诊断预测准确度分别为94.9％和79.7％，ROC曲线下面积分别为0.977和0.84;谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸等6种氨基酸为区分疾病的危险因素，用于正常和肾癌、错构瘤和肾癌2类的诊断预测准确度分别为100％和86.7％，ROC曲线下面积分别为0.996和0.88。本论文研究结果显示，相对于单个变量，综合利用多项测量指标对病人作出诊断，可能大大提高肾癌诊断的敏感性和特异性。
　　结论:
　　本论文在利用多种检测方法的代谢组学研究基础上，发现和确证了多种区分正常、肾错构瘤及肾癌的体液标志物。通过Logistic回归及ROC分析，初步筛选获得了具有较高敏感性和特异性肾癌诊断标志物组合，以此为联合参数，对已知样品进行预测，显示较高的准确度（大于79％）。利用此Logistic模型可对未知样品进行预测，为肾癌的初步筛选提供新的方法。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

第一章 前言

1．肾癌

1．1 肾癌的概况

1．2 肾癌症状和诊断方法

1．3 肾癌的鉴别诊断

1．4 肾癌的发病机制

2 代谢组学

2．1 代谢组学的产生和发展

2．2 代谢组学的研究技术和方法

3．本学位论文研究目的及所做主要工作

第二章 基于1HNMR技术的肾癌及肾错构瘤代谢组学研究

1．材料与方法

1．1 研究对象

1．2 仪器与试剂

2．实验部分

2．1 血液样品处理

2．2 尿液样品处理

2．3 1HNMR测定

2．4 健康自愿者、肾癌及错构瘤患者样品1HNMR聚类分析

2．5．导致代谢表型差异的特征峰

2．6．代谢表型差异的特征峰的鉴定和确证

3．结果

3．1 血液样品分析结果

3．2 尿液样品分析结果

4．讨论

4．1 肾癌代谢组学研究背景

4．2 肾癌及肾错构瘤与正常人群差异代谢物

4．3 肾癌及肾错构瘤涉及代谢通路分析

5 结论

第三章 基于亲水色谱技术的肾癌及肾错构瘤代澍组学研究

1．仪器与试剂

2．实验部分

2．1．实验样品

2．2．尿液前处理方法

2．3．色谱分析条件及方法

2．4 色谱峰漂移校准以及数据预处理

3．结果和讨论

3．1 尿液和血液样品前处理方法

3．2 色谱条件的选择和优化

3．3 指纹图谱方法学的验证

3．4 正常、肾癌和错构瘤患者尿液样品指纹图谱

3．5 指纹图谱色谱峰漂移校准

3．6 尿液样品聚类分析

3．7 探讨疾病状态尿液代谢表型差异的特征峰组

3．8 HPLC-HILIC-UV特征峰的鉴定

4．结论

第四章 肾癌及肾错构瘤样本中氨基酸含量的测定

1．仪器与试剂

2 实验部分

2．1、实验样品

2．2 溶液的配制

2．3 样品处理

2．4 色谱分析条件及方法

2．5 氨基酸标准溶液配置和检测

2．6 定量标准曲线

2．7 精密度实验

2．8 稳定性

2．9 测定人体样品中17种氨基酸的浓度及数据分析

3 结果与讨论

3．1 色谱条件的优化

3．2 衍生化时间对反应的影响

3．3 专属性

3．4 氨基酸测定标准曲线及检测限和定量限

3．5 氨基酸测定方法学精密度实验

3．6 稳定性

3．7 人体样品中17种氨基酸测定

4．讨论

5 结论

第五章 尿酸代谢通路代谢物检测方法建立及定量分析

1．实验仪器和材料

2 实验方法

2．1 样品及标准品配制及前处理

2．2 色谱条件

2．3 方法的线性范围、检测限和定量限

2．4 方法加样回收率实验

2．5 方法精密度考察

2．6 样品稳定性实验

2．7 人体尿液和血液样品中黄嘌呤、次黄嘌呤、尿酸和肌酐的含量测定

3 结果

3．1 色谱条件的优化

3．2 分析方法的确证

4 讨论

5 结论

第六章 肾癌及肾错构瘤诊断的Logistic回归预测模型

1 实验部分

1．1 数据来源

1．2 数据处理和方法

1．3 分析变量名及相应ROC数据

2．结果与讨论

2．1 单个变量ROC曲线面积比较

2．2 建立多因素Logistic回归模型

2．2．氨基酸数据为变量筛选肾癌诊断潜在联合标志物

3 结论

第七章 总结与展望

致谢

参考文献

攻读博士学位期间的研究成果

综述代谢组学在肾脏肿瘤中的应用