金纳米棒介导的靶向沉默吲哚胺2,3-双加氧酶2(IDO2)联合光热效应治疗小鼠的黑色素瘤

摘要

目的：
　　构建金纳米棒介导的GNR-MUA-PEI-FA纳米基因载体，检测该纳米基因载体的黑色素瘤靶向性、基因沉默效率、评估该纳米基因载体携带IDO2 siRNA与金纳米棒的光热效应联合对小鼠黑色素瘤的治疗效果。
　　方法：
　　1．参考 E-Eealy的经典的金纳米棒的合成方法合成金纳米棒对金纳米进行进一步的修饰。通过紫外光谱观察其等离子共振效应、红外光谱图观察修饰后的结构图、透射电镜观察其大小、分散度。
　　2．MTT检测修饰前后金纳米棒的对细胞的毒性。
　　3．将金纳米棒与siRNA按照不同的质量比结合，凝胶阻滞实验观察结合效果。流式细胞技术观察GNR-MUA-PEI-FA/cy3-siGAPDH进入细胞的效率、q-PCR检测GNR-MUA-PEI-FA/cy3-siRNA复合物对GAPDH的沉默效果。
　　4.在金纳米棒的浓度在15ug/ul的条件下，使用808nm的近红外激光分别使用不同的时间和功率对小鼠的黑色素瘤细胞进行光照，利用MTT进行光热效应的检测。
　　5.qPCR、WB检测 GNR-MUA-PEI-FA/siIDO2的基因沉默效果。GNR-MUA-PEI-FA/siIDO2与光照(2W/cm2,5min)联合处理小鼠的黑色素瘤细胞株B16-BL6， Annexin-V和PI染色流式细胞术检测细胞的凋亡率。
　　6.GNR-MUA-PEI-FA/cy3-siGAPDH与50％甘油、10％DMSO对小鼠的肿瘤进行皮肤涂抹。冰冻切片、荧光显微镜下观察其进入皮肤的效率。
　　7. GNR-MUA-PEI-FA/siIDO2联合光热效应治疗小鼠的黑色素瘤，观察治疗效果。
　　结果：
　　1.修饰后的金纳米棒的紫外光谱的吸收峰发生明显的红移，透射电镜下观察到修饰前后均粒子大小、分散度均没有发生明显改变。
　　2.修饰后的金纳米棒的细胞毒性要明显降低，生物相容性、生物安全性较好。
　　3.凝胶阻滞实验表明金纳米棒与siRNA的质量比在8：1时，金纳米棒刚好结合全部siRNA；为了提高siRNA的细胞摄取量，故能将提高金纳米棒与siRNA的比例为15:1。
　　4.体外光热处理B16-BL6细胞发现，在2 w/cm2、5 min的激光照射对肿瘤细胞没有直接杀伤条件下，金纳米棒的PTT的肿瘤杀伤效果最好。
　　5.动物实验显示沉默IDO2与光热效应联合治疗黑色素瘤效果最好。
　　结论：
　　1.构建的金纳米棒基因载体能有效地转染进入黑色素瘤细胞，并且沉默基因。
　　2.沉默IDO2的基因治疗与金纳米棒的光热治疗能有效地治疗小鼠的黑色素瘤。

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第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 实验动物、试剂与设备

2.1.1 实验动物及细胞株

2.1.2 主要的实验试剂

2.1.3 主要的实验设备

2.1.4 主要的试剂配制

2.2 实验方法

2.2.1 金纳米棒的合成及修饰与表征的测定

2.2.2 MTT检测修饰前后金纳米棒对细胞的毒性

2.2.3 GNR-MUA-PEI-FA对siRNA载药量的检测

2.2.4 GNR-MUA-PEI-FA/cy3-siGAPDH转染细胞的效率

2.2.5 叶酸在GNR-MUA-PEI-FA转染细胞效率中的作用

2.2.6 qPCR/WB检测GAPDH、IDO2基因沉默效果

2.2.7 Western Blot检测细胞中IDO2的沉默效果

2.2.8 MTT检测GNR-MUA-PEI-FA光热效应

2.2.9 沉默IDO2与光热效应促进肿瘤细胞凋亡的协同作用

2.2.10 GNRs-MUA-PEI-FA/siRNA透皮给药系统的构建

2.2.11. GNR-MUA-PEI-FA/siIDO2与光热效应协同治疗小鼠的黑色素瘤

2.2.12 统计学分析

第3章 结果

3.1金纳米棒的合成与修饰及表征的测定

3.2 MTT检测修饰前后两种材料对细胞的毒性

3.3凝胶阻滞实验检测GNR-MUA-PEI-FA相对于siRNA的载药量

3.4 GNR-MUA-PEI-FA-siRNA转染细胞的效率

3.5 qPCR/WB检测GAPDH、IDO2基因沉默效果

3.6 MTT检测GNR-MUA-PEI-FA的光热效应

3.7沉默IDO2与光热效应促进肿瘤细胞凋亡的协同作用

3.8透皮给药系统的构建与给药测试

3.9 GNRs-MUA-PEI-FA/siIDO2 与光热效应协同治疗小鼠的黑色素瘤

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: 肿瘤靶向治疗的研究进展