金纳米棒介导的靶向沉默吲哚胺2,3-双加氧酶1联合光热效应对Lewis肺癌的实验研究

摘要

目的： IDO1是一种重要的免疫负调控分子，在调控肿瘤的免疫逃逸中发挥非常重要的作用，它通过改变肿瘤的侵袭和转移的能力，从而影响肿瘤的临床治疗的效果。本研究以小鼠肺癌为模型构建靶向小鼠肺癌的纳米基因导入系统GNR-MUA-PEI-FA（GMPF）/siIDO1，探讨其对小鼠肺癌(Lewis lung cancer)的肿瘤靶向性、IDO1基因的沉默效果、评估该纳米靶向系统联合光热效应对小鼠肺癌的治疗作用及其机制。 方法： 1.GNR-MUA-PEI-FA纳米材料的构建；参考经典的晶种子溶液生长法合成本实验所需的金纳米棒，并对金纳米棒进行进一步的功能化修饰。通过透射电子显微镜检测金纳米棒修饰前后的大小以及分散度情况；通过酶标仪检测紫外吸收光谱，观察其表面等离子共振效应；并通过核磁共振氢谱分析检测修饰前后金纳米棒表面的化学结构式。 2.MTT法检测金纳米棒功能化修饰前后对细胞的毒性。 3.凝胶阻滞实验检测GMPF与siIDO1结合的最佳质量比例、GMPF/siIDO1结合后siRNA的释放能力以及GMPF/siIDO1在血清中的稳定性。 4.流式细胞技术检测GMPF/cy3-siGAPDH对LLC的转染效率，确定其最佳转染浓度和对LLC肺癌细胞的靶向性。 5.qPCR、WB检测GMPF/siIDO1对LLC细胞的IDO1的沉默效果。流式细胞术检测体外GMPF/siIDO1基因沉默联合光热效应对LLC细胞凋亡的影响。 6.将GMPF/cy3-siGAPDH通过尾静脉注射至C57BL/6小鼠体内，24h后取其心肝脾肺肾和肿瘤组织制成冰冻切片，荧光显微镜观察GMPF/cy3-siGAPDH靶向作用。 7.将GMPF/siIDO1通过尾静脉注射至C57BL/6小鼠体内，通过基因沉默IDO1联合GMPF光热效应协同治疗小鼠肺癌，观察对小鼠肺癌的治疗效果。 8.取各实验组小鼠肿瘤，用qPCR、WB检测肿瘤组织IDO1的沉默效果。 9.将肿瘤组织制备石蜡切片，通过免疫组化检测各组小鼠肿瘤组织中IDO1的表达情况；TUNEL法检测GMPF/siIDO1基因沉默联合光热效应对小鼠肺癌组织凋亡的影响。 结果： 1.功能化修饰后的金纳米棒（GMPF）的紫外吸收光谱发生明显红移至790nm，透射电子显微镜下观察到其大小合适、分散度良好，核磁共振氢谱分析成功检测到叶酸分子的特征性化学键结构。 2.GMPF与GMP组相比对细胞的毒性明显减低，其生物相容性和生物安全性明显提高。 3.凝胶阻滞实验表明GMPF与siIDO1的质量比在4:1时，GMPF刚好能够全部结合siIDO1；凝胶阻滞实验表明GMPF/siIDO1能够在SDS的作用下释放出siRNA并且GMPF/siIDO1能够在50%的血清中稳定保存至72小时。 4.流式细胞术检测表明GMPF/cy3-siGAPDH转染LLC细胞的最佳浓度为40μg/ml,转染效率为92.3%；另外，流式细胞术检测GMR-MUA-PEI（GMP）与GMPF转染细胞的效率，证明了GMPF对LLC细胞具有靶向性。 5.qPCR、WB结果显示GMPF/siIDO1体外对IDO1的沉默效率分别为60%、43%；流式结果显示体外GMPF/siIDO1基因沉默联合光热效应对LLC细胞凋亡百分比为38.18%。 6.组织冰冻切片结果显示，GMPF/cy3-siGAPDH通过尾静脉注射24h后，荧光物质主要蓄积在肿瘤，少量聚集在代谢器官肝脏、肾脏中，其它组织器官内未见明显聚集。 7.将GMPF/siIDO1通过尾静脉注射至C57BL/6小鼠体内后，GMPF/siIDO1组及GMPF/siIDO1+laser组肿瘤的生长速度明显减慢、肿瘤的大小明显减小、肿瘤的重量明显减轻，结果显示：GMPF/siIDO1+laser组治疗效果最好。 8.将GMPF/siIDO1通过尾静脉注射至C57BL/6小鼠体内能有效地沉默肿瘤组织IDO1的表达，qPCR及WB结果显示：GMPF/siIDO1+laser组体内实验的沉默效果分别为66%和60%。 9.IDO1免疫组化结果显示：GMPF/siIDO1+laser组肿瘤组织IDO1蛋白的表达明显降低。TUNEL结果显示：GMPF/siIDO1+laser组肿瘤组织的凋亡百分比为45%。 结论： 1.本研究成功构建的GMPF/siIDO1纳米复合物能够有效地靶向小鼠肺癌细胞，并沉默LLC细胞IDO1基因的表达。 2.体外实验证明GMPF/siIDO1通过基因沉默IDO1联合GMPF的光热效应可协同促进LLC细胞的凋亡。 3.体内实验证明GMPF/siIDO1通过基因沉默IDO1联合GMPF的光热效应可协同促进肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织的凋亡，有效地抑制了肿瘤的生长。

目录

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第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 实验动物、试剂与设备

2.2 体外实验

2.3 体内实验

第3章 结果

3.1 金纳米棒的合成与修饰及其表征的测定

3.2 GNR与GNR-MUA-PEI-FA的光热效应

3.3 凝胶阻滞试验确定GNR-MUA-PEI-FA与siIDO1结合的最适比例

3.4 GNR-MUA-PEI-FA/siIDO1 结 合 后 siRNA 的 释 放 及GNR-MUA-PEI-FA/siIDO1纳米复合物在血清中的稳定性

3.5 MTT检测GNR修饰前后对LLC细胞的毒性

3.6 GNR-MUA-PEI-FA/cy3-siGAPDH转染LLC细胞的最佳浓度

3.7 叶酸（FA）在GNR-MUA-PEI-FA转染LLC细胞中的靶向作用

3.8 qPCR、Western-blot检测GNR-MUA-PEI-FA/siIDO1体外沉默效果

3.9沉默IDO1联合光热效应促进肿瘤细胞的凋亡

3.10 冰冻切片检测GNR-MUA-PEI-FA的体内靶向性

3.11 GNR-MUA-PEI-FA/siIDO1 联合光热效应对肺癌荷瘤小鼠的治疗效果

3.12 qPCR、Western-blot检测GNR-MUA-PEI-FA/siIDO1体内沉默效果

3.13 免疫组化检测GNR-MUA-PEI-FA/siIDO1对肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织IDO1的沉默效果

3.14 TUNEL法检测GNR-MUA-PEI-FA/siIDO1沉默IDO1联合光热效应促进肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织的凋亡

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: 纳米材料在肿瘤治疗中的应用研究现状